發(fā)布時間：2020-11-04 07:28

　　 真核細(xì)胞通過選擇性自噬的方式識別胞內(nèi)細(xì)菌的過程稱為細(xì)菌自噬。細(xì)菌自噬在宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用。在細(xì)菌自噬研究中最核心的問題即宿主細(xì)胞是如何感知胞內(nèi)細(xì)菌并啟動自噬的。雖然許多課題組對此進(jìn)行過大量研究并提出很多宿主自噬系統(tǒng)主動識別胞內(nèi)細(xì)菌的假說,但現(xiàn)有的模型均不能解釋所有現(xiàn)象。在本論文中,我們從沙門氏菌感染細(xì)胞后只能引起少量自噬體形成這一表型出發(fā),首次利用細(xì)菌全基因組轉(zhuǎn)座子篩選鑒定出一個可以高效抑制細(xì)菌自噬的新型效應(yīng)蛋白(命名為SebX)。沙門氏菌的sebX缺失突變體可以使宿主通過自噬識別細(xì)菌的比例增加到80%,這解釋了為什么只有少部分野生型沙門氏菌能夠被宿主自噬反應(yīng)識別。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),SebX可以抑制不同種類細(xì)菌觸發(fā)的自噬過程,但對包括經(jīng)典自噬在內(nèi)的其它自噬通路沒有影響。SebX對細(xì)菌自噬的選擇性表明細(xì)菌自噬的發(fā)生機(jī)制與經(jīng)典自噬通路不同。接下來,為了研究細(xì)菌自噬所必需的宿主基因,我們設(shè)計(jì)并完成了基于流式細(xì)胞熒光分選的CRISPR/Cas9全基因組篩選。篩選發(fā)現(xiàn)除已知的ATG基因外,V-ATPase復(fù)合物也參與在細(xì)菌自噬過程中。一系列實(shí)驗(yàn)證明只有在細(xì)菌感染的條件下,V-ATPase可以與ATG16L1結(jié)合,并介導(dǎo)細(xì)菌自噬的起始。V-ATPase與ATG16L1的相互作用依賴于ATG16L1的WD40結(jié)構(gòu)域,并且二者的結(jié)合可以被SebX破壞。我們還證明SebX可以通過抑制V-ATPase-ATG16L1通路進(jìn)而促進(jìn)沙門氏菌在體內(nèi)的擴(kuò)散與增殖。通過解析SebX的晶體結(jié)構(gòu),我們發(fā)現(xiàn)SebX具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性(與霍亂毒素相似,它被真核蛋白ARF家族蛋白激活)。在富集修飾底物并對其進(jìn)行質(zhì)譜分析后,我們發(fā)現(xiàn)ATP6V0C(V-ATPase復(fù)合物的亞基)為SebX的底物蛋白。細(xì)菌感染分泌的SebX催化ATP6V0C第124位谷氨酰胺發(fā)生ADP-核糖基化修飾,進(jìn)而抑制細(xì)菌自噬的發(fā)生。最后,我們證明ATP6V0C第124位氨基酸決定了細(xì)菌自噬是否可以發(fā)生,但不影響經(jīng)典自噬途徑。本研究從細(xì)菌和宿主細(xì)胞兩方面出發(fā),最終同時指向V-ATPase復(fù)合物與ATG16L1的結(jié)合決定了細(xì)菌自噬的發(fā)生這一結(jié)論。效應(yīng)蛋白SebX的發(fā)現(xiàn)為了解細(xì)菌自噬的識別機(jī)制提供了關(guān)鍵的證據(jù)。V-ATPase-ATG16Ll介導(dǎo)細(xì)菌自噬的發(fā)現(xiàn)解答了長期以來關(guān)于細(xì)菌自噬識別的疑問,為細(xì)菌自噬的調(diào)控機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61;R378.22
【部分圖文】：

粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）。??細(xì)胞自嗤的概念最早在１９６３年由Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ?ｄｅ?Ｄｕｖｅ提出（Ｄｅ?Ｄｕｖｅ?ｅｔ?ａｌ．，１９６３），??即將細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)運(yùn)送到自身溶酶體（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）進(jìn)行降解的過程（圖１．１）。細(xì)胞自噬??最大的特點(diǎn)是形成一個將待降解的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)包裹起來的雙層膜泡結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)??稱之為自嗤體（ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）。長期以來，人們對于自暖過程的研究僅限于通過電??子顯微鏡觀察的形態(tài)學(xué)研宄。直到１９９２年，ＹｏｓｈｉｎｏｒｉＯｈｓｕｍｉ在釀酒酵母??ｃｅｒｅｖｉｓｉｆｌｅ）中巧妙地建立起一個可快速簡便觀察自嗤形成的模型??（Ｔａｋｅｓｈｉｇｅｅｔａｌ．，１９９２），才為細(xì)胞自噬分子生物學(xué)時代的開啟奠定基礎(chǔ)。釀酒酵母細(xì)??胞中的液泡（ｖａｃｕｏｌｅ）相當(dāng)于哺乳動物細(xì)胞中的溶酶體，含有多種蛋白酶，負(fù)責(zé)生物??大分子的降解。并且酵母的液泡結(jié)構(gòu)非常大（直徑約３?ｊｘｍ），在光學(xué)顯微鏡下就可清??晰觀察其形態(tài)。在饑餓條件下，蛋白酶缺失突變體的釀酒酵母液泡中出現(xiàn)了大量球狀??囊泡狀結(jié)構(gòu)

粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）。??細(xì)胞自嗤的概念最早在１９６３年由Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ?ｄｅ?Ｄｕｖｅ提出（Ｄｅ?Ｄｕｖｅ?ｅｔ?ａｌ．，１９６３），??即將細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)運(yùn)送到自身溶酶體（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）進(jìn)行降解的過程（圖１．１）。細(xì)胞自噬??最大的特點(diǎn)是形成一個將待降解的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)包裹起來的雙層膜泡結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)??稱之為自嗤體（ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）。長期以來，人們對于自暖過程的研究僅限于通過電??子顯微鏡觀察的形態(tài)學(xué)研宄。直到１９９２年，ＹｏｓｈｉｎｏｒｉＯｈｓｕｍｉ在釀酒酵母??ｃｅｒｅｖｉｓｉｆｌｅ）中巧妙地建立起一個可快速簡便觀察自嗤形成的模型??（Ｔａｋｅｓｈｉｇｅｅｔａｌ．，１９９２），才為細(xì)胞自噬分子生物學(xué)時代的開啟奠定基礎(chǔ)。釀酒酵母細(xì)??胞中的液泡（ｖａｃｕｏｌｅ）相當(dāng)于哺乳動物細(xì)胞中的溶酶體，含有多種蛋白酶，負(fù)責(zé)生物??大分子的降解。并且酵母的液泡結(jié)構(gòu)非常大（直徑約３?ｊｘｍ），在光學(xué)顯微鏡下就可清??晰觀察其形態(tài)。在饑餓條件下，蛋白酶缺失突變體的釀酒酵母液泡中出現(xiàn)了大量球狀??囊泡狀結(jié)構(gòu)

?Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ?Ａｕｔｏｌｙｓｏｓｏｍｅ??圖１．１細(xì)胞自噬通路示意圖（Ｃｈｏｉ?ｅｔａｌ．，２０１３）??自噬通路可以分為起始（形成雙層的隔離膜）、囊泡延伸并包裹細(xì)胞質(zhì)組分、自噬體成熟（雙層膜??封閉）、自噬溶酶體形成（與溶酶體融合）和內(nèi)容物降解幾個階段。??表１．１酵母Ａｔｇ蛋白在哺乳動物細(xì)胞中對應(yīng)的同源蛋白（Ｋｕｂａｌｌａ?ｅｔ?ａＬ，?２０１２）??Ａｔｇｌ?ＵＬＫ１／２?形成ＵＬＫ復(fù)合物，參與自噬體的起始??Ａｔｇ２?Ａｔｇ２Ａ／Ｂ?Ａｔｇｌ?８相互作用蛋白??Ａｔｇ３?Ａｔｇ３?類Ｅ２酶，參與Ａｔｇ８與ＰＥ的共價結(jié)合??Ａｔｇ４?Ａｔｇ４Ａ－Ｄ?半胱氨酸蛋白酶，切割并激活Ａｔｇ８??Ａｔｇ５?Ａｔｇ５?參與自噬體的形成與延伸??Ａｔｇ６?Ｂｅｃｌｉｎ?１?參與自嗤體的形成，與Ｖｐｓ３４形成復(fù)合物??Ａｔｇ７?Ａｔｇ７?類Ｅｌ酶，參與Ａｔｇ８與ＰＥ、Ａｔｇｌ２與Ａｔｇ５的共價結(jié)合??Ａｔｇ８?ＬＣ３Ａ／Ｂ／Ｃ；?類泛素蛋白，自噬激活時與ＰＥ形成共價連接，插入自噬??ＧＡＢＡＲＡＰ；?體膜上
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本文編號：2869813