發(fā)布時(shí)間：2020-11-03 15:09

　　 目的評(píng)價(jià)金黃色葡萄球菌(簡(jiǎn)稱金葡菌)無(wú)毒性α-毒素(alpha toxin,AT)重組蛋白的免疫原性及其在金葡菌49521(CP5型)和49525(CP8型)菌株中的免疫保護(hù)作用。方法根據(jù)NCBI中hla基因參考序列(NC_007795.1),人工合成無(wú)毒突變hla H35L基因(即mhla基因)序列,克隆至pET-28a(+)載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-mhla,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Ni柱親和層析純化,SDS-PAGE分析目的蛋白(mAT)的可溶性。用重組蛋白mAT+氫氧化鋁佐劑(試驗(yàn)組)和氫氧化鋁佐劑(對(duì)照組)分別于0、14、28 d經(jīng)腹部皮下免疫BALB/c小鼠,攻毒前1 d小鼠眼眶采血,檢測(cè)血清中IgG抗體及其亞型IgG1、IgG2a、IgG2b抗體水平;末次免疫10 d后,分別用致死劑量49521(6.0×108 CFU/只)及49525(3.0×109 CFU/只)菌液經(jīng)腹腔感染兩組小鼠,試驗(yàn)重復(fù)3次,統(tǒng)計(jì)小鼠存活率。結(jié)果經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定,重組質(zhì)粒pET-28a-mhla構(gòu)建正確。重組蛋白mAT相對(duì)分子質(zhì)量約為34 000,以可溶性形式表達(dá)。純化的重組蛋白mAT可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生滴度為1∶580 000的IgG抗體,且以IgG1亞型(抗體滴度為1∶440 000)為主。試驗(yàn)組小鼠對(duì)49521 3次攻毒的保護(hù)率分別為75.0%、70.0%和83.3%,對(duì)49525菌的保護(hù)率分別為80.0%、60.0%和80.0%,均明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。結(jié)論金葡菌無(wú)毒性重組蛋白mAT具有較好的免疫原性和免疫保護(hù)作用,可作為多抗原組分疫苗研究的候選抗原。
【部分圖文】：

結(jié)果顯示，在不同誘導(dǎo)條件下目的蛋白表達(dá)量無(wú)區(qū)別；選擇終濃度為0.1 mmol/L的IPTG,16℃誘導(dǎo)16 h為誘導(dǎo)表達(dá)條件，重組蛋白mAT相對(duì)分子質(zhì)量約為34 000（含6×His-Tag），以可溶性形式表達(dá)。見(jiàn)圖2。圖2 重組蛋白mAT的SDS-PAGE分析

重組蛋白mAT的SDS-PAGE分析

經(jīng)12%SDS-PAGE分析，純化的目的蛋白mAT相對(duì)分子質(zhì)量約為34 000，主要存在于含250和500 mmol/L咪唑的洗脫液中。見(jiàn)圖3。2.4 血清中抗體水平
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