胞內(nèi)菌能在宿主細胞內(nèi)存活和繁殖,并通過宿主細胞的遷移導致胞內(nèi)菌感染的擴散。結(jié)核分枝桿菌、傷寒沙門菌、志賀菌和李斯特菌等均屬于胞內(nèi)菌[1,2]。這些細菌對于人類健康造成很大的危害。每年約有上千萬人感染胞內(nèi)菌,其中有超過兩百萬人死于胞內(nèi)菌感染疾病。已有文獻報道發(fā)現(xiàn)某些胞內(nèi)菌感染時能夠?qū)е滤拗骷毎麅?nèi)Rab蛋白表達的變化,Rab蛋白控制著胞內(nèi)吞噬體的成熟過程[3]。如結(jié)核分枝桿菌感染后細胞內(nèi)Rab10、Rab20和Rab32均上調(diào)[4,5]。而且Rab蛋白在自噬體形成過程中也有重要的調(diào)控作用[6]。目前已證實Rab32在傷寒沙門菌和麻風分枝桿菌感染中具有重要作用[7,8]。我們的前期結(jié)果證實,DC2.4細胞中Rab32缺失時,李斯特菌感染后細胞載菌量較對照組明顯增加。李斯特菌是一種典型的胞內(nèi)菌,能夠侵入吞噬細胞和非吞噬細胞[9,10]。宿主細胞能夠識別病原體,吞噬細菌形成吞噬體,最后形成吞噬溶酶體降解細菌[11,12]。當吞噬體內(nèi)pH值下降時李斯特菌分泌李斯特菌溶血素(listeriolysin O,LLO),破壞吞噬體膜導致李斯特菌進入胞漿[13],胞漿內(nèi)的李斯特菌和含菌囊泡被分離膜包裹形成自噬體來降解細菌。已有文獻報道李斯特菌分泌的ActA蛋白能幫助細菌逃避自噬[14]。為了闡明Rab32在樹突狀細胞影響李斯特菌感染的作用和機制,我們構(gòu)建了樹突狀細胞條件敲除Rab32基因的小鼠、慢病毒轉(zhuǎn)染Rab32基因或LC3基因的細胞,以及RNA干擾Atg5基因的細胞,通過動物和細胞載菌量實驗,激光共聚焦顯微鏡技術(shù)和高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng),系統(tǒng)地研究了Rab32在樹突狀細胞感染李斯特菌中的作用。本研究的主要內(nèi)容如下:1、通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建樹突狀細胞條件敲除Rab32基因的小鼠,我們能夠觀察樹突狀細胞中Rab32對于李斯特菌感染的影響。結(jié)果顯示樹突狀細胞條件敲除Rab32基因小鼠生長發(fā)育未見異常。而且流式細胞術(shù)結(jié)果表明小鼠脾臟和外周淋巴結(jié)中樹突狀細胞的數(shù)量和表型未有明顯變化。通過尾靜脈注射制備李斯特菌系統(tǒng)感染模型,我們能夠觀察樹突狀細胞中Rab32對于李斯特菌增殖的影響。組織載菌量實驗發(fā)現(xiàn)李斯特菌感染3天后,樹突狀細胞條件敲除Rab32基因小鼠脾臟和肝臟組織細菌增殖明顯上升。實驗證實Rab32影響了李斯特菌在小鼠組織中的增殖。2、通過體外誘導培養(yǎng)骨髓來源的樹突狀細胞(Bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)進行細胞載菌量實驗,我們能夠明確Rab32對于李斯特菌在樹突狀細胞中增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)李斯特菌感染后,Rab32缺失BMDC載菌量明顯上升,以5h時為甚。為了明確樹突狀細胞內(nèi)Rab32與李斯特菌的相互作用,我們構(gòu)建了EYFP-Rab32過表達的DC2.4細胞,通過高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)分析RFP表達李斯特菌感染的細胞,發(fā)現(xiàn)Rab32囊泡能夠包裹細菌,且李斯特菌逃逸后Rab32仍能包裹細菌。接著,通過體外誘導培養(yǎng)骨髓來源的巨噬細胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs)和腹膜巨噬細胞(peritoneal macrophages)的細胞載菌量實驗,以及過表達EYFP-Rab32的RAW264.7細胞的影像學實驗,我們進一步明確Rab32抗菌作用在吞噬細胞中普遍存在。3、為了研究Rab32囊泡在李斯特菌感染的哪些階段發(fā)揮作用,我們利用△hly李斯特菌不能從吞噬體中逃逸的特性和△act A李斯特菌不能遷移的特性,通過BMDC細胞載菌量實驗發(fā)現(xiàn)Rab32缺失導致兩種細菌增殖明顯上升,Rab32在李斯特菌感染的多個階段發(fā)揮抑菌作用。為了直觀地監(jiān)測Rab32囊泡在李斯特菌感染過程中的作用,我們采用激光共聚焦顯微鏡進行熒光實時影像觀察,發(fā)現(xiàn)無論細菌是否逃逸,Rab32囊泡均能包裹細菌,且Rab32囊泡內(nèi)的細菌不能增殖。為了了解Rab32囊泡與自噬之間的關(guān)系,我們采用RNA干擾Atg5基因和高內(nèi)涵圖像分析技術(shù)進行實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Atg5缺失細胞內(nèi)Rab32囊泡數(shù)量并未發(fā)生明顯變化。為了進一步了解自噬對于Rab32囊泡功能的影響,我們進行了細胞載菌量實驗,結(jié)果顯示干擾Atg5基因后,Rab32缺失BMDC中李斯特菌增殖明顯更多。高內(nèi)涵圖像分析結(jié)果顯示雖然Rab32囊泡與LC3存在共定位,但數(shù)量很少;而且Rab32與LC3雙陽性囊泡的變化趨勢與Rab32囊泡不同,感染2h的細胞內(nèi)Rab32囊泡最少,而雙陽性囊泡最多。結(jié)果表明Rab32囊泡并不完全依賴于自噬發(fā)揮作用。結(jié)論本研究首次發(fā)現(xiàn)了Rab32具有限制李斯特菌增殖的作用,且Rab32作用并不僅僅存在于樹突狀細胞,而是吞噬細胞中普遍存在的機制。Rab32在李斯特菌感染的多個階段,甚至在李斯特菌逃逸后仍能發(fā)揮抑菌作用。Rab32通過形成囊泡參與了吞噬細胞內(nèi)抑制李斯特菌增殖的作用。綜上所述,Rab32是一種存在于吞噬細胞的,不依賴于自噬的,新穎的膜性抗菌機制。
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖 2.1 樹突狀細胞條件敲除 Rab32 基因小鼠的構(gòu)建和鑒定 Flp+CD11c+Rab32f/f小鼠構(gòu)建策略圖；B. Flp+CD11c+Rab32f/f小鼠鑒定結(jié)果圖。圖中顯示：646427 和 6429 均為 Flp+CD11c+Rab32f/f小鼠。Figure 2.1 Construction and identification of mice with Rab32 gene knockout in dendritic cel++f/f++f/f

圖 2.2 樹突狀細胞條件敲除 Rab32 基因小鼠組織中樹突狀細胞表型分析re 2.2 Phenotype analyses of dendritic cells in mice with the Rab32 gene knockout in dendritiby flow cytometry.2.2.3 李斯特菌菌量-OD600值曲線

圖 2.3 李斯特菌感染樹突狀細胞條件敲除 Rab32 基因小鼠載菌量實驗斯特菌 OD600 值與活菌數(shù)量之間的線性關(guān)系；B．樹突狀細胞條件敲除 Rab32 基因小臟和肝臟中李斯特菌載量變化。igure 2.3: Bacterial load in the liver and spleen of mice with the Rab32 gene knockout in d
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本文編號：2866814