發(fā)布時間：2020-11-01 21:25

　　 目的:通過對人類條件致病菌糞腸球菌噬菌體和植物致病菌茄科雷爾氏菌噬菌體的生物學(xué)特性及基因組學(xué)特征的研究,為噬菌體治療和噬菌體基因組學(xué)的深入研究提供理論依據(jù)。方法:以人類條件致病菌糞腸球菌(2003)為指示菌從醫(yī)院污水中分離糞腸球菌噬菌體vB_EfaP_IME195,同時以植物致病菌茄科雷爾氏菌(JW20)為指示菌從姜地土壤中分離茄科雷爾氏菌噬菌體GP4。通過對兩株噬菌體在瓊脂雙層平板上裂解宿主細(xì)菌后形成的噬菌斑、透射電子顯微鏡下噬菌體的形態(tài)、噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線、溫度敏感性、氯仿敏感性以及裂解譜的觀察,分析噬菌體的生物學(xué)特性。通過二代高通量測序法對兩株噬菌體進行測序,測序后組裝、拼接噬菌體的全基因組序列,將得到的全基因組序列進行基因組注釋、進化樹和末端分析。結(jié)果:(1)本研究以醫(yī)院臨床婦產(chǎn)科女性患者分泌物和嘔吐物中分離到的糞腸球菌(菌株2003)作為指示菌從醫(yī)院污水中分離到了一株糞腸球菌噬菌體,命名為vB_EfaP_IME195(簡稱:IME195)。該噬菌體通過PBS緩沖液梯度稀釋、雙層培養(yǎng)基平板法培養(yǎng)得到邊緣分明、斑體透明的噬菌斑;電鏡照片顯示噬菌體IME195屬于短尾噬菌體科(Podoviridae),其衣領(lǐng)部位有一個特殊的環(huán),這是短尾噬菌體科中Picovirinae亞科噬菌體所具有的特征。噬菌體IME195的最佳感染復(fù)數(shù)(Optimum complex number of infections,MOI)為0.01,一步生長曲線顯示其潛伏期約為30min,裂解量約為120 PFU/Cell。該噬菌體的裂解譜較窄,對高溫較敏感,但對5%氯仿不敏感。通過二代高通量測序獲得噬菌體IME195的全基因組序列,顯示該噬菌體基因組為線性、雙鏈DNA,基因組大小只有18655bp,GC含量僅有33.2%(GenBank登錄號:KT932700)。經(jīng)RAST注釋后僅得到27個開放閱讀框(ORFs),其中15個ORF為假象蛋白,12個ORF為已知功能蛋白。Run-off測序結(jié)果顯示,噬菌體IME195末端有59bp的反向重復(fù)序列,與屎腸球菌噬菌體IME199的末端相似。經(jīng)BLASTn比對,噬菌體IME195與一株已提交基因組序列而未發(fā)表相關(guān)論文的噬菌體有92%的相似性,與其他在NCBI庫中的噬菌體的同源性較低。(2)本研究還以茄科雷爾氏細(xì)菌(JW20)為指示菌,從姜地土壤中分離了一株茄科雷爾氏菌噬菌體GP4,該噬菌體亦屬于短尾噬菌體科。噬菌體GP4的最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)為10~(-6),一步生長曲線顯示該噬菌體的潛伏期約為2h,裂解量約為106 PFU/Cell。噬菌體GP4在40℃-70℃具有較強的生物活性,裂解譜顯示,能被裂解的16株茄科雷爾氏菌均為演化型Ⅳ型菌,而演化型I型菌均不能被噬菌體GP4裂解。通過二代高通量測序獲得全長為61129bp的雙鏈DNA基因組序列,GC含量為64%(GenBank登錄號:MH638294)。經(jīng)RAST在線注釋,該噬菌體具有83個開放閱讀框(ORFs),其中72個ORF的起始密碼子為ATG,11個ORF的起始密碼子為GTG。這83個ORF中24個為功能蛋白,12個為結(jié)構(gòu)蛋白,其余47個為假象蛋白。通過tRNAscan-SE 2.0在線軟件在噬菌體GP4基因組的25202bp和25291bp之間找到一大小為90bp的半胱氨酸t(yī)RNA(tRNA-cys)。經(jīng)BLASTn比對,噬菌體GP4與Bcep22樣病毒中的四株噬菌體具有同源性,但同源區(qū)覆蓋率較低,覆蓋率分別為Bcep22(13%)、BcepIL02(13%)、DC1(13%)以及BcepMigl(13%)。利用本研究室建立的末端分析技術(shù),在該噬菌體中沒有找到固定末端,提示該噬菌體基因組末端是隨機的。結(jié)論:(1)糞腸球菌噬菌體IME195,屬于短尾噬菌體科Picovirinae亞科。其基因組較小,末端較特殊,具有59bp的反向重復(fù)序列。所以這種簡單、特殊的噬菌體可以做為其他噬菌體基因組研究的模型。(2)茄科雷爾氏菌噬菌體GP4,屬于短尾噬菌體科Bcep22樣病毒。生物學(xué)特性實驗表明,該噬菌體能裂解大部分演化型Ⅳ型的茄科雷爾氏菌,所以可以將其做為青枯菌抗菌生物制劑。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R37
【部分圖文】：

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 噬菌體 vB_EfaP_IME195 和 GP4 的生物學(xué)特性及基因組學(xué)分2.2.2.2 糞腸球菌噬菌體 IME195 的形態(tài)以臨床分離的糞腸球菌（2003）為指示菌，從醫(yī)院污水中成功分離了一株解性糞腸球菌噬菌體。該噬菌體能在 BHI 雙層平板上形成直徑約為 1mm 的透清晰的噬菌斑，見圖 2.1A。通過掃描透射電鏡可觀察到該噬菌體具有典型的十面體結(jié)構(gòu)和無收縮的尾部，噬菌體頭部直徑約為 41nm，衣領(lǐng)部位有一突出環(huán)，這是短尾噬菌體科（Podoviridae）中 Picovirinae 亞科噬菌體所特有的形見圖 2.1B。因此，IME195 噬菌體歸為短尾噬菌體科（Podoviridae），根據(jù)國委員會對噬菌體命名的方法，該噬菌體命名 vB_EfaP_IME195。A B

碩士學(xué)位論文 噬菌體 vB_EfaP_IME195 和 GP4 的生物學(xué)特性及基因組間[55]，由圖 2.2 可以看出，IME195 噬菌體的潛伏期約 30min。一直到所有的受感染的宿主菌都被裂解死亡的整個過程則被稱為個被吸附并感染的宿主菌在最后所分解釋放出來的新的噬菌體量[56]。噬菌體的裂解量約為裂解末期噬菌體的效價/感染初期的IME195 噬菌體的裂解量約為 120PFU/cell。

圖 2.3 噬菌體 IME195 的熱穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)的確給細(xì)菌感染患者帶來了巨大的幫助，給許多在死生，但是在抗生素發(fā)揮重要作用的同時，因為人們對它的的特點，全球發(fā)生了細(xì)菌耐藥這一嚴(yán)重的問題，給患者帶來帶來了挑戰(zhàn)[57]。世界衛(wèi)生組織就此多次發(fā)聲，細(xì)菌耐藥性的問題之一，關(guān)乎著全球每個人的健康，我們每個人都應(yīng)加，噬菌體治療細(xì)菌感染是一種很有潛力的方法，可以替代道、尿道感染以及傷口感染均可通過噬菌體治療。本次研藥糞腸球菌（2003）為指示菌從醫(yī)院污水中分離了一E195 的裂解性噬菌體。通過掃描電鏡觀察到，該噬菌體屬于特殊的環(huán)，這是短尾科噬菌體中 Picovirinae 亞科噬菌體所 IME195 的這個形態(tài)特征與我們實驗室之前分離的糞腸球相似[58]。噬菌體 IME195 的裂解譜結(jié)果顯示，該噬菌體能
【相似文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王榮環(huán);噬菌體vB_EfaP_IME195和GP4的生物學(xué)特性及基因組學(xué)分析[D];蘭州大學(xué);2019年

本文編號：2866122