銅綠假單胞菌屬革蘭氏陰性菌,是常見的條件致病菌之一,主要感染免疫力低下的病人,能夠引起燒傷后感染、肺部感染、術(shù)后傷口感染等。銅綠假單胞菌在自然界中分布非常廣泛,能夠適應(yīng)多種環(huán)境,能夠抵抗多種抗生素,因此對于銅綠假單胞菌的治療并不理想。銅綠假單胞菌能夠適應(yīng)多種環(huán)境并在不同環(huán)境下引起感染與該菌含有多種轉(zhuǎn)錄因子以及復(fù)雜的毒力因子系統(tǒng)密不可分。多重耐藥外排泵系統(tǒng)是銅綠假單胞菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一。因此研究轉(zhuǎn)錄因子對耐藥外排泵的調(diào)控機制以及毒力因子在該機制中發(fā)揮的功能是至關(guān)重要的。近年來有研究表明,當外加銅綠假單胞菌自身分泌的毒力因子綠膿菌素時,外排泵MexGHI-OpmD相關(guān)基因以及抑制外排泵MexAB-OprM轉(zhuǎn)錄因子PA3721有明顯的上調(diào),因此本文通過對位于MexGHI-OpmD外排泵上游轉(zhuǎn)錄因子PA4203以及轉(zhuǎn)錄因子PA3721的研究,進一步探索綠膿菌素對于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控外排泵的影響,以及PA4203與PA3721的作用機制。本論文主要分為兩部分,第一部分為PA4203結(jié)構(gòu)與功能研究。PA4203屬LysR家族轉(zhuǎn)錄因子,具有保守的N端HTH DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,以及可變的C-末端結(jié)構(gòu)域。該家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)保守且功能廣泛,參與細胞分裂、群體感應(yīng)、毒素產(chǎn)生等多種調(diào)節(jié)途徑。本論文中,我們通過反常散射法成功地解析了轉(zhuǎn)錄因子PA4203分辨率為2.4 A的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),PA4203每個不對稱單位含有四個蛋白質(zhì)分子,并通過分析超離實驗驗證在溶液狀態(tài)下以四聚體形式存在。并且發(fā)現(xiàn)當外加綠膿菌素時,轉(zhuǎn)錄因子PA4203的表達上調(diào),驗證了 PA4203不是PYO的受體蛋白,但是對于PA4203調(diào)控外排泵MexGHI-OpmD的機制尚未研究清楚。第二部分為PA3721結(jié)構(gòu)與功能研究。PA3721屬tetR型轉(zhuǎn)錄因子,能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子MexR的阻遏物ArmR,從而間接的抑制銅綠假單胞菌中的多藥外排泵MexAB-OprM。本論文中,我們成功地解析了轉(zhuǎn)錄因子PA3721分辨率為2.1 A的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),PA3721每個不對稱單位內(nèi)有一個蛋白質(zhì)分子。經(jīng)過pisa計算及分子篩凝膠層析實驗證明其在溶液狀態(tài)下為二聚體狀態(tài)。初步發(fā)現(xiàn)PYO對PA3721的DNA結(jié)合能力無明顯影響。當敲除P43721基因后,菌體對于阿奇霉素、氯霉素、羧芐西林、諾氟沙星、氧氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星這幾種抗生素的耐藥性增強。綜合來講,本文主要研究了銅綠假單胞菌的兩種轉(zhuǎn)錄因子PA4203和PA3721的結(jié)構(gòu)及功能,初步驗證了綠膿菌素對它們功能的影響,探究了它們在多重耐藥外排泵機制中的功能。鑒于多重耐藥外排泵和綠膿菌素在銅綠假單胞菌致病性以及耐藥性中的重要作用,我們的課題有待進一步深入研究。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

圖１－２五種外排泵家族結(jié)構(gòu)模式圖（Ｐａｕｌｓｅｎ，?２００３）??根據(jù)底物的特異性，外排泵又可以分為特異性外排泵和多重耐藥性外排泵。??其中多重耐藥的外排泵類型分布較為廣泛，宿主廣泛，外排底物種類也很廣泛，??可以外排多種抗生素，對臨床治療來說是一個非常大的挑戰(zhàn)。銅綠假單胞菌的耐??藥外排泵主要屬于ＲＮＤ家族，該家族外排泵主要有三個組分：內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白??（ＭｅｘＢ，Ｄ，Ｆ，?Ｙ，?Ｋ，丨），內(nèi)膜相關(guān)質(zhì)膜融合蛋白（ＭｅｘＡ，Ｃ，Ｅ，Ｘ，Ｊ，?Ｈ）以及外排??通道蛋白（ＯｐｒＭ．．?ＬＮ，?ＯｐｍＤ）。早在２００２年，ＭｕｒａｋａｍｉＳ／．ｆ人就報道了大腸??桿菌外排栗內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白ＡｃｒＲ的晶體結(jié)構(gòu)，該蛋白為ＭｅｘＢ家族蛋白（Ｍｕｒａｋａｍｉ??ｅｔ?ａＬ?２００２）。２００４?年?Ａｋａｍａ?Ｈ?等人又解｜）「丨丨?１?／?ＭｅｘＡ?的品休結(jié)構(gòu)（Ａｋａｍａ?ｅｔ?ａｌ．，??２００４），?ＭｅｘＡＢ－ＯｐｒＭ外排泵是敁蘋證實的ＲＮＤ外排泵，其具有最廣的底物特??異性，它的外排作用導(dǎo)致野生型銅綠假單胞菌對四環(huán)素類，氯霉素類，氨基糖苷??類，大環(huán)內(nèi)酯類，Ｐ－內(nèi)酰胺類等多種抗生素產(chǎn)生耐藥。己經(jīng)有報道證明當銅綠假??單胞菌過量表達ＭｅｘＡＢ－ｏｐｒＭ外排泵蛋白時與敲除菌株相比，左氧氟沙星的最??

圖１－５綠膿菌素引起基因表達上調(diào)結(jié)果（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ?ｅｔａｌ．，２００６）??課題研究主要內(nèi)容??膿菌素是銅綠假單胞菌分泌的重要的毒力因子，并且該毒力因子在銅綠耐藥性中其重要的作用，能夠調(diào)節(jié)多種細胞功能，因此對于綠膿菌素受研宂是非常有意義的。基于課題組對于轉(zhuǎn)錄因子ＢｒｌＲ的研究，發(fā)現(xiàn)該在表達以及結(jié)合ｐｒｏｍｏｔｅｒ區(qū)執(zhí)行功能方面都受到了綠膿菌素的影響，該轉(zhuǎn)錄因子為綠膿菌素的受體蛋白（Ｗａｎｇ?ｅｔａｌ．，２０１８）。結(jié)合研究數(shù)據(jù)，篩選出了兩個轉(zhuǎn)錄因子ＰＡ４２０３以及ＰＡ３７２１。??Ａ４２０３是位于耐藥外排栗ＭｅｘＧＨｌ－ＯｐｍＤ上游的轉(zhuǎn)錄因子，當外加綠膿ＭｅｘＧＨＩ－ＯｐｍＤ外排泵相關(guān)基因有明顯的上調(diào)。這種顯著的轉(zhuǎn)錄上調(diào)是轉(zhuǎn)錄因子ＰＡ４２０３來調(diào)控的呢？?ＰＡ４２０３是否為綠膿菌素的受體蛋白呢？??

ＰＡ４２０３屬于ＬｙｓＲ型轉(zhuǎn)錄因子，ＬｙｓＲ型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（ＬＴＴＲｓ）形成一個??大而多樣的調(diào)節(jié)因子家族，其具有保守的Ｎ端ＨＴＨ?ＤＮＡ結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及可??變的Ｃ－末端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通常負責與不同受體的結(jié)合（Ｍａｄｄｏｃｋｓ?＆?Ｏｙｓｔｏｎ．??２００８）。ＬｙｓＲ型轉(zhuǎn)錄因子的功能廣泛且保守，其可以參與細胞分裂、群體感應(yīng)、??毒素產(chǎn)生等多種調(diào)節(jié)途徑（Ｃａｏ?ｅｔ?ａｌ．，?２００１；?Ｋｉｍ?ｅｔ?ａｌ．，２００４；?Ｌｉｉ?ｅｔ?ａｌ．．?２００７）。３－硝??基丙酸酯（３－ＮＰＡ）是由植物和真菌產(chǎn)生的硝基毒素（Ｆｒａｎｃｉｓ?ｅｔ?ａｌ．．?２０１２：?Ｆｒａｎｃｉｓ?ｅｔ??ａｌ．，２０１３），在生理條件下可以與其共軛堿丙酸－３－硝酸酯（Ｐ３Ｎ）平衡存在，Ｐ３Ｎ??能夠抑制三羧酸（ＴＣＡ）循環(huán)酶琥珀酸脫氫酶的活性（Ｈｕａｎｇ?ｅｔ?ａｌ．，２００６），而??ＰＡ４２０２是Ｐ３Ｎ單加氧酶，能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為丙二酸半醛進而形成乙酰輔酶Ａ。己??有研究表明ＰＡ４２０３結(jié)合ＰＡ４２０２－?ＰＡ４２０３之間１０７?ｂｐ區(qū)，并且當敲除ＰＡ４２０３??后，細菌表現(xiàn)出對３－ＮＰＡ敏感性增力ｎ（Ｖｅｒｃａｍｍｅｎ?ｅｔ?ａｌ．，２０１５）。與此同時，轉(zhuǎn)錄??因子位十耐藥外排泵ＭｅｘＧＨＩ－Ｏｐｍ【）的上游，因此對于轉(zhuǎn)錄因子ＰＡ４２０３的研究??是非常有必要的。??３Ｈ（，??．＾??
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本文編號：2862383