背景和目的構(gòu)建組織工程毛囊實現(xiàn)毛囊再生是治療禿發(fā)較有前景的方案。構(gòu)建組織工程毛囊三大經(jīng)典要素分別為:種子細胞、細胞支架和信號分子。毛乳頭細胞(dermal papilla cells,DPCs)是毛囊重建重要的種子細胞。但是,在常規(guī)二維培養(yǎng)過程中,DPCs隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸喪失其毛發(fā)誘導能力。短時間內(nèi)大量獲取具有誘導能力的DPCs仍比較困難。因此,改善DPCs體外培養(yǎng)條件,擴增細胞數(shù)量的同時維持甚至增強其誘導能力至關(guān)重要。此外,尋找一種合適的毛囊組織工程支架材料也很有必要。富含血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)經(jīng)激活后可釋放出大量的生長因子,可促進細胞增殖、分化,臨床研究表明PRP可用于禿發(fā)的治療,促進毛發(fā)生長。PRP凝膠結(jié)構(gòu)呈漁網(wǎng)狀,細胞在膠內(nèi)可存活并增殖,是一種合適的組織工程支架材料。因此,我們在本實驗中通過在培養(yǎng)基中添加激活的PRP改善DPCs體外培養(yǎng)條件,并對PRP凝膠作為細胞支架用于毛囊重建及用于DPCs三維培養(yǎng)的可行性進行了探討。該研究結(jié)果,不僅為快速獲取大量的具有誘導能力的DPCs提供新的方法,也為禿發(fā)的治療提供新策略。方法1.PRP對小鼠及人來源DPCs生物學影響的研究兩步離心法提取PRP,經(jīng)激活后將不同濃度的激活的PRP上清液添加至培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠及人DPCs,通過CCK8增殖試驗篩選出最佳促DPCs增殖的PRP上清液濃度,并對最佳濃度培養(yǎng)條件下的DPCs進行免疫熒光、Western-blot、PCR檢測PRP對DPCs生物學活性和特性的影響。通過動物體內(nèi)毛囊重建模型檢測DPCs誘導能力。2.PRP對人DPCs生物學影響的機制研究通過免疫熒光及Western-blot對人DPCs細胞表面磷酸化受體表達情況進行了檢測,并通過人磷酸化蛋白芯片對受體所介導的信號通路進行了檢測。3.PRP凝膠作為細胞支架用于毛囊重建的研究將DPCs、上皮細胞與適量的PRP混合后經(jīng)凝血酶激活形成包含生發(fā)細胞的PRP凝膠,將此凝膠移植至裸鼠背部創(chuàng)面,觀察毛囊重建的情況。4.PRP凝膠作為人DPCs三維培養(yǎng)支架的可行性研究將不同數(shù)量級及不同代數(shù)的人DPCs接種至PRP凝膠上進行培養(yǎng),觀察細胞生長狀況及聚集成球情況。結(jié)果1.PRP對小鼠及人來源DPCs生物學的影響低濃度激活的PRP可促進人和鼠DPCs增殖,其中5%濃度具有最強的促DPCs增殖作用。對添加5%激活的PRP培養(yǎng)條件下的DPCs的生物學功能指標進行了蛋白水平及基因水平檢測,發(fā)現(xiàn)與其誘導能力相關(guān)的標記物ALP、β-catenin及Versican較對照組均表達上調(diào)。動物實驗證實添加5%激活的PRP培養(yǎng)的小鼠DPCs較普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的DPCs具有更強的毛囊誘導能力。而人DPCs與新生鼠上皮細胞通過微型小室法移植并不能重建出毛囊。2.PRP對人DPCs生物學影響的機制研究添加5%激活的PRP培養(yǎng)條件下的DPCs細胞表面磷酸化受體FGFR1,PDGFRα及PDGFRβ蛋白表達水平明顯上調(diào)。蛋白芯片結(jié)果顯示人DPCs磷酸化ERK,JUK,p38及Akt信號蛋白表達水平均出現(xiàn)明顯上調(diào),GSK-3信號蛋白表達水平下調(diào)。3.PRP凝膠作為細胞支架用于毛囊重建的研究包含小鼠DPCs及新生鼠上皮細胞的PRP凝膠移植到裸鼠背部創(chuàng)面后可重建出新的毛囊,且毛發(fā)拔除后能夠再生新的毛發(fā)。而包含人DPCs及人包皮上皮細胞的PRP凝膠移植到裸鼠背部創(chuàng)面后不能重建出新的毛囊。4.PRP凝膠作為人DPCs三維培養(yǎng)支架的研究人DPCs以0.5×104、1×104、2×104每孔的數(shù)量級接種至96孔板PRP凝膠上培養(yǎng),細胞既不貼壁生長也不聚集成球;增大密度至5×104時,每孔僅可見數(shù)個細胞聚集體形成,且形狀不規(guī)則,細胞間連接不緊密,其他絕大部分細胞均呈接種時的圓形狀態(tài);低代與高代DPCs生長方式相似。結(jié)論1.培養(yǎng)基中添加5%激活的PRP上清液可明顯促進小鼠及人DPCs的增殖,并增強其毛囊誘導能力。2.PRP促進人DPCs增殖并增強其誘導能力是通過上調(diào)磷酸化受體FGFR1,PDGFRα及PDGFRβ的表達,從而激活MAPK、Akt及Wnt信號通路。3.PRP凝膠可作為細胞支架用于組織工程毛囊再生。4.PRP凝膠不適用于人DPCs的三維培養(yǎng)。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

?博士學位論文???結(jié)果??１．?ＤＰ的形態(tài)、貼壁及細胞遷出??顯微鏡下觀察可見，使用顯微解剖法結(jié)合酶消化法獲得的ＤＰ形態(tài)完整，呈??半透明的卵圓形，小鼠觸須ＤＰ體積較人頭皮ＤＰ體積要小些（圖ｌａ）。ＤＰ在接種??后２ｄ，大部分已貼壁，且部分ＤＰ周圍可見少量細胞遷出，遷出的ＤＰＣｓ呈長梭??形或多邊形（圖ｌｂ），外觀類似于真皮成纖維細胞。５ｄ后，在ＤＰ組織周圍可見較??多長梭形細胞遷出，圍繞ＤＰ組織呈同心圓樣放射狀排列（圖ｌｃ）。７－８ｄ后，ＤＰ??內(nèi)的細胞基本全部遷出。小鼠觸須ＤＰＣｓ與人頭皮ＤＰＣｓ外形及細胞遷出方式相??似，但體積小于人頭皮ＤＰＣｓ。??

。，多長梭形細胞遷出，圍繞ＤＰ組織呈同心圓樣放射狀排列（圖ｌｃ）。７－８ｄ后，ＤＰ??內(nèi)的細胞基本全部遷出。小鼠觸須ＤＰＣｓ與人頭皮ＤＰＣｓ外形及細胞遷出方式相??似，但體積小于人頭皮ＤＰＣｓ。??Ｈ??圖１－１．小鼠觸須ＤＰＣｓ的體外原代培養(yǎng)及觀察。ａ．顯微解剖法結(jié)合酶消化法分離獲得的ＤＰ．??ｂ．ＤＰ接種２ｄ后；ｃ．ＤＰ接種５ｄ后。比例尺＝５００阿。??Ｆｉｇｕｒｅ?１?－１．?Ｔｈｅ?ｉｓｏｌａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ?ｍｉｃｅ?ｖｉｂｒｉｓｓａｅ?ｄｅｒｍａｌ?ｐａｐｉｌｌａ?ｃｅｌｌｓ?ｉｎ?ｖｉｔｒｏ．??ａ．?Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｄｅｒｍａｌ?ｐａｐｉｌｌａ?ａｆｔｅｒ?ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ?ｃｏｍｂｉｎｅｄ?ｗｉｔｈ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?；?ｂ．?Ａｆｔｅｒ?２??ｄａｙｓ?ｏｆ?ｃｕｌｔｕｒｅ?；?ｃ．?ａｆｔｅｒ?５?ｄａｙｓ?ｏｆ?ｃｕｌｔｕｒｅ．?Ｓｃａｌｅ?ｂａｒｓ＝５００｜ｉｍ．??

為了探討不同濃度ａＰＲＰ對小鼠觸須及人頭皮ＤＰＣｓ活性的影響，我們采用??ＣＣＫ－８檢測了培養(yǎng)不同時間的小鼠觸須ＤＰＣ和人頭皮ＤＰＣｓ的吸光度值，并且??將代表細胞增殖的吸光度值進行統(tǒng)計分析。如圖２ａ所示，低濃度ａＰＲＰ可促進??小鼠觸須ＤＰＣｓ增殖，５％?ａＰＲＰ具有最強的促進ＤＰＣｓ増殖的作用，在培養(yǎng)第５ｄ??時最明顯。但是，高濃度ａＰＲＰ?（１０％和１５％）并不具有促進小鼠觸須ＤＰＣｓ增??殖的作用。不同濃度ａＰＲＰ對人頭皮ＤＰＣｓ活性的影響與小鼠觸須ＤＰＣｓ相似，??低濃度ａＰＲＰ可促進人頭皮ＤＰＣｓ增殖，５％?ａＰＲＰ具有最強的促進ＤＰＣｓ增殖的??作用，而高濃度ａＰＲＰ并不能促進人頭皮ＤＰＣｓ增殖（圖２ｂ）。??１５??
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells[J];Cell Research;2002年01期

本文編號：2861810