背景:剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)的棒狀體蛋白(rhoptry protein)18(TgROP18)是弓形蟲在入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)關(guān)鍵的毒力因子。TgROP18通常通過(guò)與其靶標(biāo)宿主蛋白發(fā)生相互作用以調(diào)控宿主細(xì)胞的功能,然而,目前的研究只鑒定出了少數(shù)幾個(gè)能與I型蟲株ROP18(TgROP18Ⅰ)結(jié)合的宿主細(xì)胞蛋白,對(duì)于TgROP18Ⅰ與宿主蛋白相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍未闡明;且大多數(shù)的研究都只關(guān)注在TgROP18Ⅰ,對(duì)于II型蟲株ROP18(TgROP18Ⅱ)在人細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)蛋白及作用機(jī)制更是未知。TgROP18在小鼠體內(nèi)的作用機(jī)制是通過(guò)靶定小鼠的免疫相關(guān)GTPase(immunity-related GTPases,IRGs)使其發(fā)生磷酸化而失活,從而阻止納蟲泡膜的破裂,保護(hù)弓形蟲的寄生環(huán)境。然而在人細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到此IRGs系統(tǒng),因此TgROP18在人細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制尚不清楚。本研究進(jìn)行了 TgROP18Ⅰ及TgROPl8Ⅱ在人細(xì)胞中的相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并對(duì)TgROP18Ⅰ在人細(xì)胞內(nèi)結(jié)合NMI并干擾NMI功能的作用機(jī)制進(jìn)行探究。方法:運(yùn)用高通量雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)技術(shù)從18,414個(gè)人細(xì)胞蛋白cDNA表達(dá)庫(kù)中篩選出與TgROP18Ⅰ或TgROP18Ⅱ互作的人細(xì)胞蛋白,運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)及免疫共沉淀(Co-IP)方法對(duì)蛋白互作進(jìn)行驗(yàn)證,并運(yùn)用生物信息學(xué)的方法分析TgROP18Ⅰ或TgROP18Ⅱ在人細(xì)胞中的相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)。運(yùn)用Co-IP及免疫熒光(IFA)方法驗(yàn)證TgROP18Ⅰ與人蛋白N-Myc互作因子(N-Myc and STAT interactor,NMI)在弓形蟲感染的情況下的相互作用。運(yùn)用基因定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因弓形蟲株,鑒定TgROP18Ⅰ與NMI互作的必需氨基酸位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)比在TgROP18Ⅰ存在或不存在的條件下,NMI在總的細(xì)胞中、細(xì)胞質(zhì)組分中、細(xì)胞核組分中、及染色質(zhì)GAS區(qū)域中蛋白水平的差異,評(píng)價(jià)TgROP18Ⅰ對(duì)NMI蛋白水平及NNMI核轉(zhuǎn)移的影響。通過(guò)蟲株增殖能力評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)確定TgROP18Ⅰ對(duì)蟲株IFN-y抵抗力的影響。結(jié)果:本研究從18,414個(gè)人蛋白cDNA表達(dá)庫(kù)中,共鑒定出了492個(gè)與TgROP18Ⅰ相互作用的蛋白及141個(gè)與TgOP18Ⅱ相互作用的蛋白。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示大部分的TgROP18Ⅰ 及TgROP18Ⅱ相互作用蛋白與宿主的免疫反應(yīng)及細(xì)胞凋亡相關(guān)。其中NMI、IL20RB、IL21、及UBC通過(guò)FRET及Co-IP實(shí)驗(yàn)被證實(shí)為TgROP18Ⅰ的靶標(biāo)蛋白。在感染CEP+TgROP18Ⅰ蟲株的細(xì)胞中,NMI可特異地被TgROP18Ⅰ靶定而聚集在納蟲泡膜上。TgROP18Ⅰ的激酶活性及激酶結(jié)構(gòu)域中的第439位精氨酸為TgROP18Ⅰ與NMI互作所必需,去除TgROP18Ⅰ的激酶活性或?qū)gROP18Ⅰ的第439位精氨酸突變?yōu)楦彼釋⑵茐腡gROP18Ⅰ與NMI的結(jié)合。TgROP18Ⅰ可降低細(xì)胞中NMI的蛋白水平,并影響NMI向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移及結(jié)合至GAS區(qū)域上。結(jié)論:在人細(xì)胞中,TgROP18通過(guò)與宿主蛋白互作,發(fā)揮調(diào)控宿主細(xì)胞的功能,尤其是與宿主免疫及細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作,有利于弓形蟲實(shí)現(xiàn)免疫逃避,促進(jìn)其胞內(nèi)寄生。弓形蟲在感染過(guò)程中,TgROP18Ⅰ通過(guò)其激酶活性及激酶結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵位點(diǎn)Arg-439結(jié)合NMI,并抑制NMI向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移及與GAS區(qū)域的結(jié)合,顯著干擾NMI蛋白的定位及功能。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R382.5
【部分圖文】：

（３９．０％）?ａｒｅ?ｅｎｒｉｃｈｅｄ?ｉｎ?ａ?ＰＰＩ?ｎｅｔｗｏｒｋ?ｗｉｔｈ?４４?ｅｄｇｅｓ．??此外，我們還運(yùn)用ＩＰＡ數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)７＾ＲＯＰ１８Ｉ＆ｒｇＲＯＰ１８ｎ相互作用蛋白相??關(guān)的人細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)行了分析（圖１－７）。在４９２個(gè)ｒｇＲＯＰ１８ｉ相互作用蛋白中，??７１個(gè)（占所有ｒｇＲＯＰ１８＃互作用蛋白的１４．４％）相互作用蛋白富集在３４個(gè)不??同的信號(hào)通路上；而在１４１個(gè)ｒｇＲＯＰＷＨ相互作用蛋白中，１３個(gè)（占所有??ｒｇＲＯＰＷｉＪｇ互作用蛋白的９．２％）相互作用蛋白富集在１６個(gè)不同的信號(hào)通路上。??ＴｇＲＯＰ１８ｉ相互作用蛋白前５位被富集的信號(hào)通路分別是：ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ?ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ??ｆａｃｔｏｒ２?信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ＥＩＦ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）?（ｐ＝１．２＞＜１０－４）；?ＪＡＫ１?及?ＪＡＫ３?在?ｙｃ?細(xì)胞因子??信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用（ｒｏｌｅｏｆＪＡＫｌａｎｄＪＡＫＪｉｎｙｃｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ）?（ｐ＝１．０４ｘｌ〇＿??３）；粒細(xì)胞的黏附及滲出（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ?ａｄｈｅｓｉｏｎ?ａｎｄ?ｄｉａｐｅｄｅｓｉｓ）?（ｐ＝５．０１＞＜１０－３）；??Ｔｕｂｂｙ?介導(dǎo)的?Ｇ?蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｂｙ?Ｔｕｂｂｙ?）（ｐ＝５．３７ｘｌ〇－??３）

??發(fā)生相互作用（圖２－２Ｂ）。于是我們開始探索位于ｒｇＲ０Ｐ１８ｉ的ｖａｃｕｏｌｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ??ｄｏｍａｉｎ內(nèi)的全部６個(gè)ｒｇＲＯＰｌＡ特有的氨基酸殘基對(duì)于其與ＮＭＩ結(jié)合的重要性。??我們運(yùn)用?Ｇｉｂｓｏｎ?Ａｓｓｅｍｂｌｙ?的方法［丨０７］，將?ＴｇＲ０Ｐ１８丨與?ｒｇＲ０Ｐ１８ｎ?的?ｖａｃｕｏｌｅ？??ｔａｒｇｅｔｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ?和激酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了互換，構(gòu)建了兩株轉(zhuǎn)基因蟲株?—??ＣＥＰ＋：ＴｇＲＯＰ１８－ｄｏｍａｉｎｓｗａｐ?ｌ（ＣＥＰ＋ｒｇＲＯＰ１８－ＤＳｌ，；ＴｇＲ０Ｐ１８ｉｉ的Ｎ端＋ｒｇＲ０Ｐ１８ｉ??的激酶結(jié)構(gòu)域）和?ＣＥＰ＋ｒｇＲＯＰ１８－ｄｏｍａｉｎｓｗａｐ２（ＣＥＰ＋７＾ＲＯＰ１８－ＤＳ２，?：ＴｇＲ０Ｐ１８ｉ??的Ｎ端＋ＴｇＲ０Ｐ１８ｎ的激酶結(jié)構(gòu)域）。免疫熒光的結(jié)果顯示，ＲＯＰ１８－ＤＳ１突變體??仍然可與ＮＭＩ結(jié)合，而ＲＯＰ１８－ＤＳ２突變體卻不能與ＮＭＩ結(jié)合，說(shuō)明位于??７＾０？１８１激酶結(jié)構(gòu)域的多態(tài)性位點(diǎn)才是ＴｇＲ０Ｐ１８Ａ?ＮＭＩ結(jié)合這個(gè)表型所必需??的（圖?２－２Ｃ）。??１１４??

??達(dá)量的增加而減少，呈現(xiàn)明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系（圖２－６Ｃ）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，??即使轉(zhuǎn)染等量（２ｐｇ）的ｐＥＹＦＰ－ＮＭＩ表達(dá)質(zhì)粒，在梯度轉(zhuǎn)染了不同量（０，?０．５，??１，或２呢）的ｐＥＣＦＰ－ｒｇＲＯＰｌｈ表達(dá)質(zhì)粒的情況下，ＮＭＩ的蛋白水平仍會(huì)隨著??ｒｇＲＯＰ＾表達(dá)量的增加而減少（圖２－６Ｄ）－為了確定７＾１？疋１８１對(duì)ＮＭＩ蛋白的??抑制效應(yīng)是否是由于Ｔ＾ＲＯＰｌ＾引起ＮＭＩ蛋白的降解導(dǎo)致的，我們使用了蛋白??酶體抑制劑ＭＧ１３２來(lái)處理細(xì)胞（圖２－６Ｅ）。結(jié)果顯示在蛋白酶體被抑制的情況??下，７＾１１０？１８１對(duì)＿１的蛋白的抑制能力并沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明此抑制效應(yīng)是不??依賴于蛋白酶體的（圖２＿６Ｅ）。綜上，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明ＧＲＯＰＩＡ降低細(xì)胞中ＮＭＩ??的蛋白水平，而對(duì)ＮＭＩ的基因轉(zhuǎn)錄沒(méi)有影響。??１２２??
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