背景與目的胸腺是T細(xì)胞分化成熟的中樞免疫器官,骨髓來(lái)源的淋巴細(xì)胞共同前體經(jīng)血管和淋巴管進(jìn)入胸腺,在胸腺分化成熟的T細(xì)胞再經(jīng)血管、淋巴管輸出到達(dá)外周免疫器官定居。血管和淋巴管是細(xì)胞遷入、遷出胸腺的必由之路,血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞在該過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IFN-γ是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子,對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞MHC分子和黏附分子的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。另一方面,胸腺細(xì)胞從胸腺輸出還與細(xì)胞分化成熟狀態(tài)及CD62L、1-磷酸鞘氨醇受體1(sphingosine 1-phosphate receptor 1,S1P1)的表達(dá)高度相關(guān)。表達(dá)S1P1的胸腺細(xì)胞受1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)的趨化而發(fā)生遷移。S1P主要由紅細(xì)胞產(chǎn)生,在血液和淋巴液中的濃度高于淋巴器官,這種S1P濃度梯度是細(xì)胞遷出淋巴器官所必須的。近來(lái)還發(fā)現(xiàn)S1P裂解酶(S1P lyase,SPL)在胸腺基質(zhì)細(xì)胞、胸腺髓質(zhì)PVS區(qū)、血管內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá),可催化S1P不可逆性降解,從而保持胸腺內(nèi)S1P濃度在較低水平,是成熟胸腺細(xì)胞遷出胸腺的重要保證。重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis,MG)是器官特異性自身免疫性疾病,許多文獻(xiàn)已報(bào)道MG患者胸腺及外周T細(xì)胞亞群比例異常,且在胸腺內(nèi)形成針對(duì)AChR抗原特異性的Tfh和B細(xì)胞構(gòu)成的生發(fā)中心,同時(shí),MG患者胸腺中多種趨化因子異常高表達(dá),提示MG患者胸腺和外周之間存在異常的淋巴細(xì)胞遷出或遷入。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MG患者胸腺微環(huán)境中多種細(xì)胞因子表達(dá)異常,其中IL-6、TGFβ1、IFN-γmRNA表達(dá)與對(duì)照組胸腺相比明顯增加。同時(shí)這些MG患者胸腺中S1P1~+、CD62L~+胸腺細(xì)胞增多,而且這些細(xì)胞大多聚集在脈管內(nèi)或其周圍,提示MG患者可能存在胸腺細(xì)胞輸出異常。為探討MG胸腺細(xì)胞異常輸出與胸腺微環(huán)境中異常高表達(dá)的細(xì)胞因子IL-6、TGFβ1、IFN-γ之間的關(guān)系,本研究首先采用免疫組化和免疫熒光對(duì)MG胸腺組織中S1P1、CD62L、CD31、LYVE1的表達(dá)量和分布進(jìn)行分析,其中S1P1、CD62L為介導(dǎo)胸腺細(xì)胞遷出的關(guān)鍵分子,CD31為內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志分子、LYVE1為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志性分子,然后采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)及人胸腺淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(Human lymphatic endothelial cell,HLEC)培養(yǎng),通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)和Western Blot檢測(cè)IL-6/TGFβ1/IFN-γ對(duì)HUVEC和HLEC黏附分子、趨化因子及SPL等表達(dá)的影響,分析MG胸腺微環(huán)境對(duì)血管及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)胸腺細(xì)胞遷出的調(diào)控機(jī)理,為進(jìn)一步研究MG胸腺異常的機(jī)制和提高診療水平提供科學(xué)依據(jù)。方法(1)研究對(duì)象:試驗(yàn)組為臨床確診的MG患者,AChRAb陽(yáng)性,行胸腺切除術(shù)治療,胸腺病理分型為非胸腺瘤,有典型濾泡增生;對(duì)照組為非MG心臟手術(shù)患者。(2)MG胸腺細(xì)胞遷出相關(guān)分子的表達(dá):取MG患者和對(duì)照組胸腺,進(jìn)行石蠟包埋、制作組織切片,采用免疫組化、免疫熒光染色對(duì)胸腺組織中S1P1、CD62L、CD31、LYVE1的表達(dá)、分布及其相關(guān)性進(jìn)行分析。免疫組化檢測(cè)胸腺組織中ICAM-1、VCAM-1、SPL的表達(dá)與分布。免疫組化定量分析:應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)胸腺組織石蠟切片免疫組化結(jié)果進(jìn)行定量分析,采用累積光密度值(IOD)來(lái)表示組化結(jié)果的陽(yáng)性程度。(3)IL6/TGFβ1/IFN-γ對(duì)HUVEC生物學(xué)特性的影響:體外培養(yǎng)HUVEC,IL6/TGFβ1/IFN-γ刺激HUVEC后RT-qPCR檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5、CCL19、CCL21 mRNA表達(dá)水平的變化;Western Blot檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表達(dá)水平的變化。(4)IL6/TGFβ1/IFN-γ對(duì)HLEC生物學(xué)特性的影響:取先天性心臟病患兒胸腺,流式分選HLEC進(jìn)行體外培養(yǎng),IL6/TGFβ1/IFN-γ刺激HLEC后RT-qPCR檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5、CCL19、CCL21 mRNA表達(dá)水平的變化;Western Blot檢測(cè)ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表達(dá)水平的變化。(5)IL6/TGFβ1/IFN-γ胸腺內(nèi)注射對(duì)C57BL/6小鼠胸腺組織的影響:將IL6/TGFβ1/IFN-γ分別對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行胸腺內(nèi)注射,免疫組化檢測(cè)其胸腺組織結(jié)構(gòu)的變化及胸腺內(nèi)ICAM-1的表達(dá)與分布。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布,采用兩獨(dú)立樣本之間的t檢驗(yàn),結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,當(dāng)P0.05時(shí),認(rèn)為差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)MG胸腺細(xì)胞遷出相關(guān)分子的表達(dá)(1)MG胸腺中S1P1、CD62L、CD31和LYVE1的表達(dá):免疫組化及免疫熒光結(jié)果顯示MG胸腺組織皮髓結(jié)構(gòu)分界較不明顯,髓質(zhì)區(qū)域縮小。MG患者S1P1~+胸腺細(xì)胞和CD62L~+胸腺細(xì)胞增多,且多分布在脈管內(nèi)和其周圍。MG患者胸腺中CD31~+內(nèi)皮細(xì)胞和LYVE1~+淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增多,在皮質(zhì)、髓質(zhì)均有分布。(2)MG胸腺中ICAM-1、VCAM-1和SPL的表達(dá):MG患者胸腺組織中ICAM-1~+細(xì)胞、VCAM-1~+細(xì)胞及SPL~+細(xì)胞數(shù)量均增多,ICAM-1~+細(xì)胞和SPL~+細(xì)胞大多分布在髓質(zhì)區(qū),VCAM-1~+細(xì)胞多分布在小葉間。綜上所述,提示MG患者胸腺細(xì)胞輸出增多。(2)IL6/TGFβ1/IFN-γ對(duì)HUVEC生物學(xué)特性的影響(1)HUVEC表達(dá)粘附分子、趨化因子和SPL mRNA水平的變化:IFN-γ刺激HUVEC后引起ICAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5 mRNA水平顯著增高(P0.05),VCAM-1 mRNA水平早期降低,72 h表達(dá)增加,CCL19、CCL21mRNA水平降低(P0.05);IL6刺激HUVEC后ICAM-1、VCAM-1、SPL mRNA水平增高(P0.05),HLA-A、HLA-DR mRNA水平無(wú)顯著變化(P0.05),CCL21mRNA水平早期降低,隨后增高,CCL5、CCL19 mRNA水平降低(P0.05);TGFβ1刺激組ICAM-1、SPL mRNA表達(dá)水平早期增高(P0.05),VCAM-1 mRNA水平一過(guò)性增高,72 h HLA-A mRNA水平降低(P0.05),24 h HLA-DR mRNA水平降低(P0.05),CCL5、CCL19、CCL21 mRNA水平顯著降低(P0.05)。(2)HUVEC表達(dá)ICAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白水平的變化:IFN-γ刺激HUVEC后ICAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表達(dá)水平增高;IL6刺激HUVEC后ICAM-1、SPL蛋白表達(dá)水平增高;TGFβ1刺激后ICAM-1、SPL蛋白表達(dá)水平增高。(3)IL6/TGFβ1/IFN-γ對(duì)HLEC生物學(xué)特性的影響(1)HLEC表達(dá)粘附分子、趨化因子和SPL mRNA水平的變化:IFN-γ刺激HLEC后ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR、CCL5 mRNA水平顯著增高(P0.05),CCL19 mRNA水平早期降低,72 h升高,CCL21 mRNA水平顯著降低(P0.05);IL6刺激HLEC后ICAM-1、HLA-A、CCL19、CCL21mRNA水平早期降低(P0.05),SPL mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P0.05),VCAM-1、HLA-DR、CCL5 mRNA水平隨時(shí)間的增加而升高,72 h升高明顯(P0.05);TGFβ1刺激組ICAM-1、VCAM-1、HLA-DR mRNA水平顯著降低(P0.05),SPL mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P0.05),HLA-A、CCL5、CCL19、CCL21 mRNA水平早期降低(P0.05)。(2)HLEC表達(dá)ICAM-1、VCAM1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白水平的變化:IFN-γ刺激HLEC后ICAM-1、VCAM-1、SPL、HLA-A、HLA-DR蛋白表達(dá)水平增高;IL-6刺激組HLA-DR蛋白表達(dá)水平增高;TGFβ1刺激組HLA-DR蛋白表達(dá)水平降低。(4)IL6/TGFβ1/IFN-γ胸腺內(nèi)注射對(duì)C57BL/6小鼠胸腺組織的影響IL6/TGFβ1/IFN-γ分別對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行胸腺內(nèi)注射后,組化結(jié)果顯示IFN-γ及IL6注射組小鼠胸腺組織皮髓結(jié)構(gòu)界限不明顯,髓質(zhì)區(qū)域縮小。IFN-γ注射后,小鼠胸腺內(nèi)ICAM-1的表達(dá)量顯著增加,這些改變與MG患者胸腺有相似之處。結(jié)論MG胸腺微環(huán)境異常高表達(dá)的IFN-γ可通過(guò)增高血管和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞SPL、黏附分子的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)S1P1~+和CD62L~+細(xì)胞從胸腺輸出。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

.1 MG 與非 MG 患者胸腺組織 S1P1 的表達(dá)與m 石蠟切片 S1P1 免疫組化染色。上圖：MG 患右側(cè) 200×，右下角 400×）；下圖：非 MG 患右側(cè) 200×，右下角 400×）。B. 組化定量統(tǒng)計(jì)（IOD）表示 S1P1 的表達(dá)量，*P<0.05，**P< CD62L 主要分布在脈管內(nèi)或其周圍，非 膜下。MG 患者胸腺中 CD62L+胸腺細(xì)胞（ MG 患者（2980983±386838）（P<0.05）非 MGMG

23注：A. 胸腺組織 3 μm 石蠟切片 CD62L 免疫組化染色。上圖：MG 患者 CD62L 組化染色（放大倍數(shù)：左側(cè) 100×，右側(cè) 200×，右下角 400×）；下圖：非 MG 患者 CD62L 組化染色（放大倍數(shù)：左側(cè) 100×，右側(cè) 200×，右下角 400×）。B. 組化定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果，應(yīng)用 ImageJ軟件，以累積光密度值（IOD）表示 CD62L 的表達(dá)量，*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。

（3）MG 與非 MG 患者 CD31 在髓質(zhì)區(qū)、皮質(zhì)區(qū)均有表達(dá)，髓質(zhì)區(qū)表達(dá)較多，MG 患者 CD31 的表達(dá)量（53262027±13863690）顯著高于非 MG 患者（2611439±224818）（P<0.05），提示 MG 患者胸腺中可能存在脈管增生。（如圖3.3）A
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本文編號(hào)：2857746