一、研究背景與目的鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)是一種重要的醫(yī)院院內(nèi)感染病原菌,是引起醫(yī)院獲得性肺炎,尤其是呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的重要病原菌,也經(jīng)常引起尿路感染、創(chuàng)傷感染、腦膜炎、腹膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎癥等感染類(lèi)型,鮑曼不動(dòng)桿菌可以進(jìn)入血流,引起菌血癥,并有可能進(jìn)一步發(fā)展為敗血癥[1]。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)重,臨床分離株中發(fā)現(xiàn)其耐藥往往是多種耐藥機(jī)制的共同作用的結(jié)果。藥物外排泵機(jī)制是鮑曼不動(dòng)桿菌重要的耐藥機(jī)制,迄今為止已發(fā)現(xiàn)20余種外排泵,可以大致分為5大外排泵家族,其中最重要的為RND外排泵家族。鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株具有能夠從環(huán)境中獲取耐藥基因的能力,對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥機(jī)制往往多種耐藥機(jī)制共同起作用,多種機(jī)制混雜在一起,從而造成藥物泵出外排機(jī)制對(duì)細(xì)菌耐藥的獨(dú)立貢獻(xiàn)難以評(píng)估,而且由單獨(dú)由外排泵機(jī)制所產(chǎn)生的耐藥限度的研究也比較少。我們希望通過(guò)體外誘導(dǎo)選擇的方式獲得外排泵機(jī)制的誘導(dǎo)耐藥菌株,從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平兩種維度去研究包含鮑曼不動(dòng)桿菌多種外排泵與外膜蛋白基因的系統(tǒng)影響碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的耐藥機(jī)制。二、研究方法和結(jié)果研究方法:首先,我們選擇了一株亞胺培南敏感的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(SZE株),通過(guò)添加亞胺培南的選擇壓力下,連續(xù)58代次傳代誘導(dǎo)選擇的方法,獲得了 SZE株的亞胺培南誘導(dǎo)株,監(jiān)測(cè)誘導(dǎo)的過(guò)程中菌株在去除和添加外排泵抑制劑CCCP的藥敏變化;其次,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄定量PCR的方法,比較了 SZE株(G1)和其誘導(dǎo)株(G45)藥物外排泵以及外膜蛋白在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量變化情況,初步研究了造成誘導(dǎo)過(guò)程中亞胺培南耐藥的外排泵和外膜蛋白的耐藥機(jī)制;最后,通過(guò)iTRAQ同位素標(biāo)記結(jié)合LC/MS技術(shù),將鮑曼不動(dòng)桿菌SZE株(G1)和其誘導(dǎo)株(G45)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分別標(biāo)記,利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行各種外排泵和外膜蛋白在蛋白質(zhì)水平上的鑒定和定量比較,分析了 SZE株在持續(xù)的亞胺培南誘導(dǎo)下,多種外排泵和外膜蛋白在亞胺培南耐藥機(jī)制中的作用。研究結(jié)果:1.近年來(lái)鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株對(duì)妥布霉素、亞胺培南、頭孢曲松抗菌藥物的耐藥性上升超過(guò)10%。在深圳市某三甲醫(yī)院所分離的1167株臨床株中,與2012-2013年度相比,2014-2015年度鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床分離株對(duì)妥布霉素、亞胺培南、頭孢曲松、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等種類(lèi)抗菌藥物耐藥性均升高10%以上。2.鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株中不同亞胺培南耐藥水平的鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵基因adeB、adeJ的檢出率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。根據(jù)CLSI藥敏標(biāo)準(zhǔn)判斷,臨床分離株中不同亞胺培南耐藥水平的鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵基因adeB、adeJ的檢出率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),臨床株中攜帶外排泵adeB、adeJ基因與亞胺培南耐藥正相關(guān)。3.鮑曼不動(dòng)桿菌SZE株在亞胺培南(IPM)58代次的選擇誘導(dǎo)下,最小抑菌濃度(MIC)從開(kāi)始的0.125μg/ml上升到8μg/ml。通過(guò)篩選鮑曼不動(dòng)桿菌菌株庫(kù),選定一株泌尿道感染來(lái)源的菌株并命名為SZE株;對(duì)其進(jìn)行亞胺培南耐藥的58代次的體外誘導(dǎo)選擇中,SZE株對(duì)亞胺培南的藥物敏感性逐漸下降,對(duì)IPM藥敏平板上IPM抑菌圈直徑從開(kāi)始的24.5mm逐漸減小到13.8mm,最小抑菌濃度(MIC)從開(kāi)始的0.125μg/ml上升到8μg/ml,根據(jù)CLSI對(duì)K-B法和肉湯稀釋法亞胺培南藥敏的解讀,該菌株藥敏判讀從“敏感”變?yōu)椤爸薪椤薄?.亞胺培南誘導(dǎo)過(guò)程中,鮑曼不動(dòng)桿菌SZE株通過(guò)外排泵RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ表達(dá)水平分別上調(diào)了 6.9、4.0和2.1倍,獲得亞胺培南的適應(yīng)性耐藥性。經(jīng)外排泵抑制試驗(yàn),在亞胺培南誘導(dǎo)過(guò)程中SZE株所產(chǎn)生的亞胺培南藥物敏感性下降基本上可以被外排泵抑制劑CCCP中和,我們推測(cè)該菌株誘導(dǎo)耐藥的機(jī)制跟耐藥泵機(jī)制相關(guān)。鮑曼不動(dòng)桿菌SZE株經(jīng)過(guò)多代的亞胺培南誘導(dǎo)選擇,轉(zhuǎn)錄水平的多種外排泵基因表達(dá)量顯著上調(diào),RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ表達(dá)上調(diào)超過(guò)2倍以上;外膜蛋白的carO,omp33,ompA,ompW和oprD表達(dá)量變化不顯著。其中RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ分別上調(diào)了 6.9、4.0和2.1倍,MATE家族的abeM上調(diào)1.8倍,MFS家族tetB上調(diào)1.7倍,MATE家族的abeM上調(diào)1.8倍,SMR家族的abeS上調(diào)1.4倍。而MFS家族的craA,amvA變化不顯著。而鮑曼不動(dòng)桿菌亞胺培南誘導(dǎo)株(G45)外膜蛋白基因carO,omp33,ompA,ompW和oprD表達(dá)量變化不顯著。誘導(dǎo)過(guò)程中,所攜帶的內(nèi)源性blaOXA-51表達(dá)量變化不顯著。5.鮑曼不動(dòng)桿菌RND外排泵家族AdeABC的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因adeRS系統(tǒng)中,adeR基因序列的第58位易突變位點(diǎn),該位點(diǎn)由G變?yōu)锳是造成adeB相對(duì)表達(dá)量上調(diào)6.9的原因。adeRS系統(tǒng)中adeR基因序列的第58位發(fā)生了鳥(niǎo)嘌呤突變?yōu)橄汆堰?G變?yōu)锳),這個(gè)突變?cè)斐葾deR蛋白質(zhì)序列中第20位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０?而這個(gè)突變或許是造成adeB相對(duì)表達(dá)量上調(diào)6.9的原因。6.通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,篩選了 AdeB等5個(gè)外排泵相關(guān)蛋白和OmpA等7個(gè)膜相關(guān)蛋白是潛在的開(kāi)發(fā)新型抗鮑曼不動(dòng)桿菌的藥物的靶標(biāo)蛋白。SZE株經(jīng)過(guò)多代的亞胺培南誘導(dǎo)選擇,蛋白質(zhì)水平上外排泵相關(guān)蛋白表達(dá)量上升 1.5 倍的有 5 個(gè):分別為 AdeAmembranefusionprotein、AdeB、pH adaptation potassium efflux system transmembrane protein、pH adaptation potassium efflux system D transmembrane protein、Putative RND family drug transporter。而RND家族外排泵AdeABC組成蛋白AdeA和AdeB蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量上升分別為2.45和2.47。亞胺培南誘導(dǎo)株(G45)膜相關(guān)蛋白在蛋白質(zhì)水平表達(dá)量表達(dá)量下降超過(guò)2倍的有7個(gè),分別為Putative membrane protein、Putative membrane protein、MFS permease、Outer membrane protein assembly factor BamE、Putative membrane protein、OmpA/MotB、Outer-membrane lipoprotein carrier protein、Outer-membrane lipoprotein LolB。外膜蛋白表達(dá)量的下降可能與亞胺培南誘導(dǎo)株(G45)獲得的耐藥機(jī)制相關(guān)。這些所篩選的蛋白質(zhì)水平上表達(dá)量發(fā)生變化的外排泵和外膜蛋白,或許可以作為開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物的潛在的靶標(biāo)蛋白。通過(guò)以上研究,分別在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平分析了 SZE株在持續(xù)的亞胺培南誘導(dǎo)下,多種外排泵和外膜蛋白在亞胺培南耐藥中的作用機(jī)制。三、結(jié)論首先,我們研究發(fā)現(xiàn)近年來(lái)鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性上升明顯,攜帶外排泵adeB、adeJ基因與亞胺培南耐藥正相關(guān)。2012-2015年來(lái)鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性上升明顯,特別是妥布霉素、亞胺培南、頭孢曲松、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等種類(lèi)抗菌藥物耐藥性均升高10%以上。臨床分離株中不同亞胺培南耐藥水平的鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵基因adeB、adeJ的檢出率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),臨床株中攜帶外排泵adeB、adeJ基因與亞胺培南耐藥正相關(guān)。其二,臨床常用的抗菌藥物亞胺培南(商品名泰能)是一種潛在的鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥誘導(dǎo)劑。鮑曼不動(dòng)桿菌SZE株經(jīng)亞胺培南(IPM)58代次的選擇誘導(dǎo)下,對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的敏感性逐漸下降,最小抑菌濃度(MIC)從開(kāi)始的0.125μg/ml上升到8μg/ml。再三,外排泵RND家族AdeABC、AdeFGH和AdeIJK的表達(dá)上調(diào)是鮑曼不動(dòng)桿菌SZE株耐藥性增強(qiáng)的重要原因,而外排泵調(diào)節(jié)系統(tǒng)-adeRS系統(tǒng)中重要位點(diǎn)發(fā)生的單核苷酸突變?cè)斐葾deABC外排泵的表達(dá)水平上升。鮑曼不動(dòng)桿菌可以通過(guò)上調(diào)外排泵的表達(dá)水平,特別是RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ表達(dá)水平獲得亞胺培南的耐藥性;鮑曼不動(dòng)桿菌RND外排泵家族AdeABC的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因adeRS系統(tǒng)中,adeR基因序列的第58位易突變位點(diǎn),該位點(diǎn)由G變?yōu)锳可能是造成adeB相對(duì)表達(dá)量上調(diào)6.9的原因;其四,在缺少碳青霉烯酶耐藥機(jī)制協(xié)同作用情況下,外排泵機(jī)制對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌適應(yīng)性耐藥的獨(dú)立貢獻(xiàn)有限。亞胺培南敏感的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(SZE株),通過(guò)在亞胺培南作用下,連續(xù)58代次傳代誘導(dǎo)選擇的方法,獲得了 SZE株的亞胺培南誘導(dǎo)株最小抑菌濃度(MIC)從開(kāi)始的0.125μg/ml上升到8μg/ml,但是該菌株在缺少碳青霉烯酶耐藥機(jī)制協(xié)同作用情況下,通過(guò)上調(diào)外排泵表達(dá)水平作用機(jī)制,藥敏結(jié)果根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀:經(jīng)過(guò)58代誘導(dǎo),藥敏趨于穩(wěn)定,誘導(dǎo)作用的最大效果是由“敏感”變?yōu)椤爸薪椤?一直都無(wú)法進(jìn)一步變成“耐藥”。最后,通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,篩選了 AdeB等5個(gè)外排泵相關(guān)蛋白和OmpA等7個(gè)膜相關(guān)蛋白可能成為潛在的開(kāi)發(fā)新型抗鮑曼不動(dòng)桿菌的藥物的靶標(biāo)蛋白。綜上所述,本研究中我們從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平兩種維度去研究包含鮑曼不動(dòng)桿菌多種外排泵與外膜蛋白基因的系統(tǒng)影響碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的耐藥機(jī)制,外排泵耐藥機(jī)制,特別是RND外排泵家族家族在鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥中發(fā)揮重要作用,為多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(MDR-AB)的臨床治療和新型抗菌藥物的研制提供理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：R378
【部分圖文】：

成細(xì)菌耐藥。細(xì)菌外膜屬于半透性膜，對(duì)抗生素和其他生物大分子均構(gòu)成屏障，??外膜上存在通道蛋白，又稱(chēng)為膜孔蛋白（ｐｏｒｉｎｓ），組成親水性通道，通道內(nèi)親水??的小分子物質(zhì)可以自由通過(guò)，如圖１－２所示。鮑曼不動(dòng)桿菌外膜通透性極低，大??約只有大腸埃希菌（￡．ｃｒｏ／Ｄ的１％－３％。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌減少膜孔蛋白表達(dá)從而??有效降低外膜通透性機(jī)制也是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的重要原??因之一，這種細(xì)菌外膜異常低通透性造成進(jìn)入菌體內(nèi)的抗菌藥物的有效濃度降??低，從而導(dǎo)致了抗生素耐藥。??８??

（ｍｕｌｔｉｄｒａｇ?ａｎｄ?ｔｏｘｉｃ?ｃｏｍｐｏｕｎｄ?ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ?ｆａｍｉｌｙ，ＭＡＴＥ）、ＡＴＰ?偶聯(lián)盒超家族??（ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ?ｃａｓｓｅｔｔｅ?ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ＡＢＣ）、小多藥耐藥家族（ｓｍａｌｌ?ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ??ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｆａｍｉｌｙ，?ＳＭＲ）［３９］（圖１－３）。這五個(gè)家族來(lái)源的外排栗在鮑曼不動(dòng)桿菌上??都有發(fā)現(xiàn)，外排泵與鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥的關(guān)系正逐漸引起人們的高度關(guān)注??［４￡）］。Ｗｅｎｓｉｓ?Ｈｕ等研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株培養(yǎng)基中加入泵抑制劑??ＣＣＣＰ后，菌株對(duì)亞胺培南的耐藥性明顯下降，ＭＩＣ降低為原菌株的四分之一以??上［４１］。??鮑曼不動(dòng)桿菌最重要的是ＲＮＤ家族的外排泵。該家族外排泵可以將氨基糖??苷類(lèi)、頭孢噻辟、四環(huán)素類(lèi)、氯霉素、甲氧芐氨嘧啶和氟喹諾酮類(lèi)藥物泵出細(xì)??菌細(xì)胞外。ＲＮＤ家族的主要成員包括ＡｄｅＡＢＣ、ＡｄｅＦＧＨ和ＡｄｅｌＪＫ。ＡｄｅＡＢＣ??１０??

顯著升高的藥物依次為ＴＺＰ（?１７．０６％）、妥布霉素（１６．１９％）、亞胺培南（１６．６５％）、??頭孢曲松（１６．５２％）、頭孢他啶（１５．４６％）。各抗生素的藥敏結(jié)果見(jiàn)表２－３。??１１６７株鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥情況如
【參考文獻(xiàn)】

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