人胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hESCs)來源于囊胚內細胞團,可以長期維持自我更新,并具有分化形成各種組織細胞的潛能。hESCs在特定條件下可分化為胰島素分泌細胞(insulin-producing cells,IPCs),用于移植治療Ⅰ型糖尿病,解決臨床治療器官來源不足的問題。MiR-375是胰腺發(fā)育和成熟過程中必不可少的轉錄調控因子,在胰島β細胞和非β細胞中均有表達,能夠提高胰島素轉錄水平,促進胰島β細胞增殖。Hi-Lnc70是在胰島β細胞發(fā)育過程中特異性高表達的lncRNA,影響β細胞形成和生理功能。因此,研究miR-375和Hi-Lnc70在hESCs向IPCs分化過程中的作用,對于提高hESCs向IPCs分化的效率,獲得單一表達Insulin的成熟胰島β細胞具有重要意義。本實驗所使用的hESCs向IPCs分化方案包括定形內胚層(Stage I)、原腸(Stage II)、內分泌前體(Stage III)和胰腺內分泌細胞(Stage IV)四個階段。通過在分化的不同階段對胰腺發(fā)育相關基因和Hi-Lnc70和miR-375的檢測,發(fā)現(xiàn)在向定形內胚層分化階段的培養(yǎng)液中添加25 ng/mL wnt3a的方案,能維持細胞良好的生長狀態(tài),同時高表達胰腺發(fā)育成熟相關基因。同時根據(jù)已經發(fā)表的人Hi-Lnc70的抑制序列,構建Hi-Lnc70的RNA干擾載體。對分化不同時期的hESCs進行脂質體介導的Hi-Lnc70抑制質粒轉染,發(fā)現(xiàn)瞬時抑制Hi-Lnc70可提高Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin表達水平,促進PDX1蛋白、胰島素、胰高血糖素和生長激素抑制素的合成。對分化不同時期的hESCs進行脂質體介導的miR-375 mimic轉染,發(fā)現(xiàn)瞬時過表達miR-375,可提高Pdx1、Insulin表達水平并促進PDX1蛋白和胰島素合成,同時降低Glucagon和Somatostatin表達水平,減少胰高血糖素和生長激素抑制素的合成,進而降低細胞多激素共表達程度。對分化不同時期的hESCs進行脂質體介導的miR-375 inhibitoror轉染,發(fā)現(xiàn)瞬時抑制miR-375,可降低Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin表達水平,減少PDX1蛋白、胰島素、胰高血糖素和生長激素抑制素的合成。本研究證明在hESCs向IPCs分化過程中抑制Hi-Lnc70和過表達miR-375可提高胰島β細胞發(fā)育成熟相關基因的表達水平。提高分化過程中細胞miR-375水平可以降低分化末期細胞多激素共表達程度,促進β細胞成熟和胰島素合成。抑制miR-375則降低胰島β細胞發(fā)育成熟相關基因的表達水平,為深入研究非編碼RNA在胰島發(fā)育中的作用提供了新的思路。
【學位單位】：內蒙古大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

引自 Non-Coding RNA in Pancreas and β-Cell Develo輸miRNA 在細胞內被分選并隨后選擇性地分泌到細于細胞間信號傳導至關重要[102, 103]。包裹在微泡（ AGO2[105]或脂蛋白[106, 107]結合的 miRNA 都可以被能。多泡體（MVB）是含有多個小囊泡的內體的特化小）在 MVB 與質膜融合后釋放。通過質膜的向外出m），隨后釋放到細胞外空間中。外泌體內的 miRN同時表明外泌體 miRNA 轉移是一種選擇性過程[108-1轉移，而且還可以保護它們免受 RNase 降解，由于

圖 2 不同濃度 Wnt3a 對 hESCs 在分化培養(yǎng)液中生長狀態(tài)的影響Stage I、Stage II、Stage III 和 Stage IV 分別表示分化階段，wnt3a + 、wnt3a ++和 wnt3a 分別表示 25ng/mLwnt3a、50ng/mL 和不添加 wnt3a 的方案。（標尺為 200 μm）Figure 2 Effects of different concentration of Wnt3a on morphology of hESCs at different stagesStage I, Stage II, Stage III and Stage IV indicate stages of differentiation, wnt3a + ,wnt3a ++ and wndicate the medium of the first protocol of adding 25 ng/mLwnt3a, 50 ng/mLwnt3a and without wnt3a. (The s200 μm)1.2 不同濃度 Wnt3a 對人胚胎干細胞定向分化為胰島 β 細胞的影響如圖 3 所示，以未分化的細胞作為對照，Gapdh 作為內參基因，通過實時熒光定量 P方法，檢測所有鑒定細胞中胰向分化相關基因 Somatostatin、Glucagon、Insulin、Pdx1、Ngnxcr4 和 Foxa2 的表達。分析整個分化的趨勢，F(xiàn)oxa2 和 Cxcr4 作為終末內胚層標志性基因

30圖 3 不同濃度 Wnt3a 對 hESCs 向 IPCs 分化過程中胰腺相關基因相對表達量的影響Stage I、Stage II、Stage III 和 Stage IV 分別表示分化階段，wnt3a + 、wnt3a ++和 wnt3a 分別表示 25ng/mLwnt3a、50ng/mL 和不添加 wnt3a 的方案。
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本文編號：2856606