人胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hESCs)來源于囊胚內(nèi)細胞團,可以長期維持自我更新,并具有分化形成各種組織細胞的潛能。hESCs在特定條件下可分化為胰島素分泌細胞(insulin-producing cells,IPCs),用于移植治療Ⅰ型糖尿病,解決臨床治療器官來源不足的問題。MiR-375是胰腺發(fā)育和成熟過程中必不可少的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在胰島β細胞和非β細胞中均有表達,能夠提高胰島素轉(zhuǎn)錄水平,促進胰島β細胞增殖。Hi-Lnc70是在胰島β細胞發(fā)育過程中特異性高表達的lncRNA,影響β細胞形成和生理功能。因此,研究miR-375和Hi-Lnc70在hESCs向IPCs分化過程中的作用,對于提高hESCs向IPCs分化的效率,獲得單一表達Insulin的成熟胰島β細胞具有重要意義。本實驗所使用的hESCs向IPCs分化方案包括定形內(nèi)胚層(Stage I)、原腸(Stage II)、內(nèi)分泌前體(Stage III)和胰腺內(nèi)分泌細胞(Stage IV)四個階段。通過在分化的不同階段對胰腺發(fā)育相關(guān)基因和Hi-Lnc70和miR-375的檢測,發(fā)現(xiàn)在向定形內(nèi)胚層分化階段的培養(yǎng)液中添加25 ng/mL wnt3a的方案,能維持細胞良好的生長狀態(tài),同時高表達胰腺發(fā)育成熟相關(guān)基因。同時根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的人Hi-Lnc70的抑制序列,構(gòu)建Hi-Lnc70的RNA干擾載體。對分化不同時期的hESCs進行脂質(zhì)體介導(dǎo)的Hi-Lnc70抑制質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)瞬時抑制Hi-Lnc70可提高Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin表達水平,促進PDX1蛋白、胰島素、胰高血糖素和生長激素抑制素的合成。對分化不同時期的hESCs進行脂質(zhì)體介導(dǎo)的miR-375 mimic轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)瞬時過表達miR-375,可提高Pdx1、Insulin表達水平并促進PDX1蛋白和胰島素合成,同時降低Glucagon和Somatostatin表達水平,減少胰高血糖素和生長激素抑制素的合成,進而降低細胞多激素共表達程度。對分化不同時期的hESCs進行脂質(zhì)體介導(dǎo)的miR-375 inhibitoror轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)瞬時抑制miR-375,可降低Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin表達水平,減少PDX1蛋白、胰島素、胰高血糖素和生長激素抑制素的合成。本研究證明在hESCs向IPCs分化過程中抑制Hi-Lnc70和過表達miR-375可提高胰島β細胞發(fā)育成熟相關(guān)基因的表達水平。提高分化過程中細胞miR-375水平可以降低分化末期細胞多激素共表達程度,促進β細胞成熟和胰島素合成。抑制miR-375則降低胰島β細胞發(fā)育成熟相關(guān)基因的表達水平,為深入研究非編碼RNA在胰島發(fā)育中的作用提供了新的思路。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

引自 Non-Coding RNA in Pancreas and β-Cell Develo輸miRNA 在細胞內(nèi)被分選并隨后選擇性地分泌到細于細胞間信號傳導(dǎo)至關(guān)重要[102, 103]。包裹在微泡（ AGO2[105]或脂蛋白[106, 107]結(jié)合的 miRNA 都可以被能。多泡體（MVB）是含有多個小囊泡的內(nèi)體的特化�。┰� MVB 與質(zhì)膜融合后釋放。通過質(zhì)膜的向外出m），隨后釋放到細胞外空間中。外泌體內(nèi)的 miRN同時表明外泌體 miRNA 轉(zhuǎn)移是一種選擇性過程[108-1轉(zhuǎn)移，而且還可以保護它們免受 RNase 降解，由于

圖 2 不同濃度 Wnt3a 對 hESCs 在分化培養(yǎng)液中生長狀態(tài)的影響Stage I、Stage II、Stage III 和 Stage IV 分別表示分化階段，wnt3a + 、wnt3a ++和 wnt3a 分別表示 25ng/mLwnt3a、50ng/mL 和不添加 wnt3a 的方案。（標尺為 200 μm）Figure 2 Effects of different concentration of Wnt3a on morphology of hESCs at different stagesStage I, Stage II, Stage III and Stage IV indicate stages of differentiation, wnt3a + ,wnt3a ++ and wndicate the medium of the first protocol of adding 25 ng/mLwnt3a, 50 ng/mLwnt3a and without wnt3a. (The s200 μm)1.2 不同濃度 Wnt3a 對人胚胎干細胞定向分化為胰島 β 細胞的影響如圖 3 所示，以未分化的細胞作為對照，Gapdh 作為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量 P方法，檢測所有鑒定細胞中胰向分化相關(guān)基因 Somatostatin、Glucagon、Insulin、Pdx1、Ngnxcr4 和 Foxa2 的表達。分析整個分化的趨勢，F(xiàn)oxa2 和 Cxcr4 作為終末內(nèi)胚層標志性基因

30圖 3 不同濃度 Wnt3a 對 hESCs 向 IPCs 分化過程中胰腺相關(guān)基因相對表達量的影響Stage I、Stage II、Stage III 和 Stage IV 分別表示分化階段，wnt3a + 、wnt3a ++和 wnt3a 分別表示 25ng/mLwnt3a、50ng/mL 和不添加 wnt3a 的方案。
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本文編號：2856606