利用單純皰疹病毒I型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)標準株F細菌人工染色體(HSV-BAC)系統(tǒng)構(gòu)建的HSV重組病毒由于存在tk基因缺陷,無法表達胸苷激酶,影響病毒潛伏/激活,故需對該基因進行修復。為此,本研究建立了tk1基因敲除的Vero細胞株(tk1-Vero),并利用該細胞株建立了次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脫氧核苷(Hypoxanthine-aminopurine-thymidine,HAT)選擇性培養(yǎng)液篩選方法,對經(jīng)同源重組方式完成tk基因修復的病毒進行篩選。首先,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除Vero細胞tk1基因,通過有限稀釋法建立tk1-Vero細胞株,采用DNA測序和Western Blot對tk1-Vero細胞株進行鑒定;比較HSV(F)和tk-HSV(F)在tk1-Vero細胞和tk基因缺陷的人骨肉瘤143細胞中的增殖情況;在tk1-Vero細胞中,采用HAT選擇性培養(yǎng)液篩選方法,對tk基因修復病毒進行篩選。結(jié)果顯示,本研究成功建立了穩(wěn)定的tk1-Vero細胞株;與143細胞相比,tk1-Vero細胞更適于病毒增殖及tk基因修復病毒的篩選;最后在tk1-Vero細胞中,利用HAT選擇性培養(yǎng)液成功篩選出tk基因修復病毒。本研究表明,采用tk1-Vero細胞株建立的HAT選擇性培養(yǎng)液篩選方法可以對tk基因修復病毒進行高效快速篩選。
【部分圖文】：

對經(jīng)p Cas-Guide質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及BUd R定向篩選后的tk1-Vero細胞進行DNA測序，結(jié)果顯示，本研究設(shè)計的2條針對tk1基因外顯子的靶向序列：5"-GGCTCTCCCAGCAAGACCCG-3"和5"-GGAGAGCCGGGCAGCACGGT-3"，均成功引導了Cas9對靶位點的剪切（圖1A、1B）。利用有限稀釋法建立tk1-Vero細胞株后，對該細胞株再次進行DNA測序，確認了tk1基因的穩(wěn)定敲除（圖1C）。2 Western Blot鑒定tk1-Vero細胞株

Western Blot結(jié)果顯示，與親本Vero細胞對比，未見tk1-Vero細胞表達相應胸苷激酶。3感染后48h tk+HSV(F）與tk-HSV(F）分別在tk1-Vero細胞與143細胞中空斑形成數(shù)

HSV潛伏/激活受多種病毒基因及宿主細胞基因調(diào)控，我們往往通過敲除病毒某個自身基因，或?qū)⑺拗骰虿迦氩《净蚪M研究其調(diào)控機制，然后觀察重組病毒潛伏/激活水平的變化，從而了解目的基因?qū)Σ《緷摲?激活的影響，并進一步研究其分子機制，因此實驗中經(jīng)常需要構(gòu)建重組病毒。圖4 Western Blot鑒定tk基因修復后胸苷激酶的表達
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