利用單純皰疹病毒I型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)標(biāo)準(zhǔn)株F細(xì)菌人工染色體(HSV-BAC)系統(tǒng)構(gòu)建的HSV重組病毒由于存在tk基因缺陷,無(wú)法表達(dá)胸苷激酶,影響病毒潛伏/激活,故需對(duì)該基因進(jìn)行修復(fù)。為此,本研究建立了tk1基因敲除的Vero細(xì)胞株(tk1-Vero),并利用該細(xì)胞株建立了次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脫氧核苷(Hypoxanthine-aminopurine-thymidine,HAT)選擇性培養(yǎng)液篩選方法,對(duì)經(jīng)同源重組方式完成tk基因修復(fù)的病毒進(jìn)行篩選。首先,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除Vero細(xì)胞tk1基因,通過(guò)有限稀釋法建立tk1-Vero細(xì)胞株,采用DNA測(cè)序和Western Blot對(duì)tk1-Vero細(xì)胞株進(jìn)行鑒定;比較HSV(F)和tk-HSV(F)在tk1-Vero細(xì)胞和tk基因缺陷的人骨肉瘤143細(xì)胞中的增殖情況;在tk1-Vero細(xì)胞中,采用HAT選擇性培養(yǎng)液篩選方法,對(duì)tk基因修復(fù)病毒進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示,本研究成功建立了穩(wěn)定的tk1-Vero細(xì)胞株;與143細(xì)胞相比,tk1-Vero細(xì)胞更適于病毒增殖及tk基因修復(fù)病毒的篩選;最后在tk1-Vero細(xì)胞中,利用HAT選擇性培養(yǎng)液成功篩選出tk基因修復(fù)病毒。本研究表明,采用tk1-Vero細(xì)胞株建立的HAT選擇性培養(yǎng)液篩選方法可以對(duì)tk基因修復(fù)病毒進(jìn)行高效快速篩選。
【部分圖文】：

對(duì)經(jīng)p Cas-Guide質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及BUd R定向篩選后的tk1-Vero細(xì)胞進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果顯示，本研究設(shè)計(jì)的2條針對(duì)tk1基因外顯子的靶向序列：5"-GGCTCTCCCAGCAAGACCCG-3"和5"-GGAGAGCCGGGCAGCACGGT-3"，均成功引導(dǎo)了Cas9對(duì)靶位點(diǎn)的剪切（圖1A、1B）。利用有限稀釋法建立tk1-Vero細(xì)胞株后，對(duì)該細(xì)胞株再次進(jìn)行DNA測(cè)序，確認(rèn)了tk1基因的穩(wěn)定敲除（圖1C）。2 Western Blot鑒定tk1-Vero細(xì)胞株

Western Blot結(jié)果顯示，與親本Vero細(xì)胞對(duì)比，未見tk1-Vero細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)胸苷激酶。3感染后48h tk+HSV(F）與tk-HSV(F）分別在tk1-Vero細(xì)胞與143細(xì)胞中空斑形成數(shù)

HSV潛伏/激活受多種病毒基因及宿主細(xì)胞基因調(diào)控，我們往往通過(guò)敲除病毒某個(gè)自身基因，或?qū)⑺拗骰虿迦氩《净蚪M研究其調(diào)控機(jī)制，然后觀察重組病毒潛伏/激活水平的變化，從而了解目的基因?qū)Σ《緷摲?激活的影響，并進(jìn)一步研究其分子機(jī)制，因此實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常需要構(gòu)建重組病毒。圖4 Western Blot鑒定tk基因修復(fù)后胸苷激酶的表達(dá)
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