類鼻疽是由類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei,簡稱類鼻疽菌)感染引起的一種熱帶醫(yī)學疾病,廣泛流行分布于東南亞和澳洲北部等地,我國海南、臺灣、香港等地也為主要的疫源地。類鼻疽臨床表現(xiàn)形式多樣,除了引起亞臨床感染、局部的膿腫外,還可導致重癥肺炎和急性敗血癥等,死亡率高達40%。由于類鼻疽菌耐藥性強,培養(yǎng)易等特點,早在2006年美國CDC就將其列為I類生物戰(zhàn)劑。隨著研究的深入,大量的證據(jù)表明類鼻疽可能是一種人畜共患疾病。尤其是近些年一些非疫源地也相繼出現(xiàn)了類鼻疽病例的報道,如南非、中東等地,我國2008年在北京奧運會期間和2014年在江蘇鎮(zhèn)江分別發(fā)生過一起輸入性的類鼻疽病例。再加上國際交流和合作的更加頻繁,“一帶一路”的建設,海南國際旅游島的開發(fā)以及南海海洋利益維護和主權(quán)安全保障已上升至國家戰(zhàn)略要求,因此迫切需要深入研究類鼻疽菌感染致病的機理,尋找臨床治療的新策略。類鼻疽菌作為一種胞內(nèi)寄生、嚴重危害公共安全的細菌,其逃逸宿主免疫造成的持續(xù)性感染是其致病的關鍵。類鼻疽菌能夠快速地侵入宿主體內(nèi)各類細胞,并使感染細胞發(fā)生融合,為自身的復制和傳播創(chuàng)造條件,這些被感染的細胞不僅是類鼻疽菌的寄居場所,還給其提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)。近年來,一些研究發(fā)現(xiàn)在病原菌感染與免疫過程中,宿主脂質(zhì)代謝和病原菌相互作用,并為病原菌感染和復制提供能量。在結(jié)核桿菌感染早期宿主細胞甘油三酯釋放的脂肪酸和甾醇是結(jié)核桿菌休眠期間的唯一碳源;在肝炎病毒裝備和復制進程中脂質(zhì)代謝是其必不可少的能量來源。近期課題組在類鼻疽菌感染肺上皮細胞A549逃逸宿主清除機制中觀察到宿主細胞脂肪代謝發(fā)生明顯異常變化,脂質(zhì)嚴重蓄積。但是這種脂質(zhì)代謝的異常表現(xiàn)與類鼻疽菌的感染有什么關系、在其逃逸免疫中發(fā)揮什么作用、對其致病有什么生物學意義等問題尚不清楚。眾所周知,脂質(zhì)代謝參與細胞許多重要的生命活動,為各種細胞器形成、擴展、收縮等動態(tài)改變以及細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)降解等提供所需能量。而近年來研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的脂質(zhì)還可以通過自噬體轉(zhuǎn)運至溶酶體進行分解,此過程稱為脂噬作用。脂噬作為自噬的一種亞進程,被報道與多種細菌、病毒等微生物的致病和感染密切相關。李倩博士2015年在Autophagy上曾報道過類鼻疽菌感染A549細胞早期,通過誘導MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的上調(diào),進而實時、連續(xù)地抑制其靶基因ATG10表達,負性調(diào)控自噬,從而影響宿主細胞的免疫清除,促進其胞內(nèi)存活。那么,脂質(zhì)代謝的異常與類鼻疽菌感染引起的自噬過程受抑有什么關系呢?而類鼻疽菌是否是通過自噬作用調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,從而影響細菌在胞內(nèi)的增殖復制,并導致持續(xù)性感染的呢,仍有待闡明。為了探究類鼻疽菌感染過程中,自噬對脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用對類鼻疽菌胞內(nèi)生存的影響,我們首先建立了類鼻疽菌感染A549細胞模型,通過透射電鏡、Western Blot、激光共聚焦檢測了類鼻疽菌感染的A549細胞脂質(zhì)代謝和自噬水平變化情況,發(fā)現(xiàn)類鼻疽菌感染肺上皮細胞A549后脂質(zhì)嚴重蓄積,脂滴堆積,脂質(zhì)代謝關鍵分解酶活性降低;同時細胞內(nèi)AKT-mTOR自噬通路明顯受抑。其次,我們進一步驗證了自噬與脂質(zhì)代謝的關系。在藥物激活或抑制自噬、siRNA干擾等條件下,通過Western Blot、激光共聚焦觀察A549細胞脂質(zhì)代謝情況,發(fā)現(xiàn)激活自噬會明顯促進細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝;細菌胞內(nèi)計數(shù)實驗發(fā)現(xiàn)A549細胞清除胞內(nèi)類鼻疽菌的能力明顯增強。接著,為了找尋類鼻疽菌是如何通過自噬調(diào)控脂質(zhì)代謝的線索,我們通過類鼻疽菌感染A549細胞后表達譜芯片的篩選,利用生物信息學分析軟件Cluster3.0和Tree View對脂質(zhì)代謝相關基因進行了聚類分析和預測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NR1D2mRNA表達明顯上調(diào)。NR1D2(Nuclear receptor subfamily 1 group D member 2)是孤兒核受體家族成員,具有配體激活的功能。已有文獻報道NR1D2不僅能夠調(diào)節(jié)參與代謝功能的基因,如脂質(zhì)代謝和炎癥反應相關基因,還能可以作為誘導自噬的重要信號,與自噬信號通路中關鍵蛋白LC3、Beclin-1等相互作用,實現(xiàn)對自噬的調(diào)節(jié)。因此,為了探究在類鼻疽菌感染A549細胞過程中NR1D2是否介導自噬調(diào)節(jié)了脂質(zhì)代謝,我們首先利用RT-PCR和Western Blot實驗分析確證在類鼻疽菌感染A549細胞后NR1D2的表達水平明顯升高。其次,我們構(gòu)建了NR1D2干擾質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)類鼻疽菌感染宿主細胞后干擾NR1D2的表達明顯減少A549細胞中脂滴的蓄積,促進宿主細胞脂質(zhì)代謝和β-氧化的速率;同時我們還觀察到自噬信號通路的關鍵分子LC3、Beclin-1也伴隨NR1D2的抑制而上調(diào)。進一步,在抑制自噬水平的條件下,干擾NR1D2表達,通過共聚焦實驗發(fā)現(xiàn)即使干擾NR1D2的表達,相比于對照組(control+DMSO)宿主細胞脂質(zhì)代謝水平也無明顯改變,表明在類鼻疽菌感染A549細胞進程中,NR1D2介導了自噬調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。考慮到宿主脂質(zhì)代謝在病原感染進程中發(fā)揮重要作用,因此我們外源補充三醋酸甘油酯,促進胞內(nèi)脂質(zhì)代謝速率,通過細菌胞內(nèi)載量計數(shù)實驗表明激活宿主細胞脂質(zhì)代謝速率可以增強宿主細胞對類鼻疽菌的胞內(nèi)清除能力。綜上所述,本課題從脂質(zhì)代謝的角度探討了類鼻疽菌與宿主的相互作用在其感染致病中的意義,其創(chuàng)新性主要在于首次提出了“類鼻疽菌、脂噬、持續(xù)性感染”的作用模式。本文以脂噬為切入點,初步闡明了類鼻疽菌感染宿主細胞后,誘導核受體因子NR1D2的表達上調(diào),干擾細胞自噬,導致宿主細胞脂質(zhì)蓄積,從而逃避宿主免疫清除而發(fā)生持續(xù)性感染。該研究一方面揭示了脂噬是如何在類鼻疽菌的胞內(nèi)持續(xù)性感染中發(fā)揮作用的機制,另一方面也為尋找抗類鼻疽感染的新方案提供理論依據(jù)和思路借鑒。
【學位單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

Fig 1. The changes of lipid in A549 cells infected with B. pseudomallei. Representative TEMimages of uninfected (A) or A549 cells were infected by B. pseudomallei (B-D). B. pseudomallei infected A549cells (MOI=10:1) for 6 h, 12 h and 24 h, respectively. The scale bars are indicated. (E) Image J quantification ofthe number of lipid per cell in (A-D). (F) Image J quantification of the area of lipid per cell in (A-D). *p < 0.05,**p < 0.01.4.1.2 脂質(zhì)代謝成分檢測不同細胞中的脂質(zhì)體存在功能、外觀和組成上的差異，但最主要的成分是膽固醇和甘油三酯，為了進一步證實類鼻疽菌感染后宿主細胞脂質(zhì)代謝的改變情況，我們進行了多個時間點細胞脂質(zhì)形態(tài)和成分檢測。分別將類鼻疽菌感染A549 細胞 6 h、12 h、24 h 后的細胞樣品進行共聚焦檢測和 ELISA 分析，結(jié)果表明：①類鼻疽菌感染宿主細胞后，經(jīng)過尼羅紅直接浸染細胞可以觀察到胞內(nèi)脂質(zhì)體數(shù)量隨著感染時間的延長明顯增多（圖 2A 和 2B）；②類鼻疽菌感染后，宿主細胞體內(nèi)脂質(zhì)成分膽固醇和甘油三酯含量隨著感染時間的延長明顯增加（圖 2C 和 2D）。

脂質(zhì)成分膽固醇含量。（D）檢測胞內(nèi)脂質(zhì)成分甘油三脂含量。es of lipid metabolism in A549 cells infected with B. pseudomalleiMOI=10:1) infected A549 cells for 6 h, 12 h and 24 h, respectively. (A)h laser confocal microscopy. Scale bars: 5 μm. (B) Quantitative analysis of t(A). (C) Detection of intracellular lipid cholesterol content. (D) Detection oftent. *p<0.05, **p<0.01.謝關鍵酶檢測含有大量具有多種生物學功能的蛋白酶，如環(huán)氧合酶， 合 成 酶 （ Fatty acid synthase, Fasn ） 和 脂 肪 分 解 酶ride lipase, ATGL）具有至關重要的作用。為此我們通過代謝關鍵酶變化，發(fā)現(xiàn)在不同的時間點，脂肪代謝合成酶表達明顯受抑（圖 3）。

類鼻疽菌感染 A549 細胞后自噬通路關鍵蛋白結(jié)果. B. pseudomallei inhibited autophagic pathway in A549 cells. B. pseudomallei infected A54MOI = 10:1) for 6 h, 12 h and 24 h. The expression of every protein was counted. 激活自噬有利于胞內(nèi)脂質(zhì)代謝脂噬作為一種重要的自噬亞進程，在胞內(nèi)病原菌感染進程中發(fā)揮關鍵作因此，為了進一步探究自噬在類鼻疽菌感染 A549 細胞脂質(zhì)代謝中的作用，分別采用不同的藥物預處理細胞。由于自噬體的形成依賴于多種自噬蛋白與，包括 ATG5、ATG7、ATG10 等，其中 ATG5 在自噬泡的形成中發(fā)揮重用，并參與調(diào)節(jié) LC3 向自噬泡的聚集導致自噬的發(fā)生，因此根據(jù)實驗設計，處理組分別為使用自噬誘導劑雷帕霉素（Rapamycin, 200 nM）增強自噬，抑制劑 3-MA（3-methyladenine, 10 mM）和自噬沉默劑 ATG5 siRNA（100抑制自噬，通過激光共聚焦、Western Blot 等觀察類鼻疽菌感染 A549 細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝情況。其中，自噬沉默劑 ATG5 siRNA 的沉默效率通過tern Blot 和 RT-PCR 來檢測（圖 5）。
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本文編號：2852999