類鼻疽是由類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei,簡稱類鼻疽菌)感染引起的一種熱帶醫(yī)學(xué)疾病,廣泛流行分布于東南亞和澳洲北部等地,我國海南、臺(tái)灣、香港等地也為主要的疫源地。類鼻疽臨床表現(xiàn)形式多樣,除了引起亞臨床感染、局部的膿腫外,還可導(dǎo)致重癥肺炎和急性敗血癥等,死亡率高達(dá)40%。由于類鼻疽菌耐藥性強(qiáng),培養(yǎng)易等特點(diǎn),早在2006年美國CDC就將其列為I類生物戰(zhàn)劑。隨著研究的深入,大量的證據(jù)表明類鼻疽可能是一種人畜共患疾病。尤其是近些年一些非疫源地也相繼出現(xiàn)了類鼻疽病例的報(bào)道,如南非、中東等地,我國2008年在北京奧運(yùn)會(huì)期間和2014年在江蘇鎮(zhèn)江分別發(fā)生過一起輸入性的類鼻疽病例。再加上國際交流和合作的更加頻繁,“一帶一路”的建設(shè),海南國際旅游島的開發(fā)以及南海海洋利益維護(hù)和主權(quán)安全保障已上升至國家戰(zhàn)略要求,因此迫切需要深入研究類鼻疽菌感染致病的機(jī)理,尋找臨床治療的新策略。類鼻疽菌作為一種胞內(nèi)寄生、嚴(yán)重危害公共安全的細(xì)菌,其逃逸宿主免疫造成的持續(xù)性感染是其致病的關(guān)鍵。類鼻疽菌能夠快速地侵入宿主體內(nèi)各類細(xì)胞,并使感染細(xì)胞發(fā)生融合,為自身的復(fù)制和傳播創(chuàng)造條件,這些被感染的細(xì)胞不僅是類鼻疽菌的寄居場(chǎng)所,還給其提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)。近年來,一些研究發(fā)現(xiàn)在病原菌感染與免疫過程中,宿主脂質(zhì)代謝和病原菌相互作用,并為病原菌感染和復(fù)制提供能量。在結(jié)核桿菌感染早期宿主細(xì)胞甘油三酯釋放的脂肪酸和甾醇是結(jié)核桿菌休眠期間的唯一碳源;在肝炎病毒裝備和復(fù)制進(jìn)程中脂質(zhì)代謝是其必不可少的能量來源。近期課題組在類鼻疽菌感染肺上皮細(xì)胞A549逃逸宿主清除機(jī)制中觀察到宿主細(xì)胞脂肪代謝發(fā)生明顯異常變化,脂質(zhì)嚴(yán)重蓄積。但是這種脂質(zhì)代謝的異常表現(xiàn)與類鼻疽菌的感染有什么關(guān)系、在其逃逸免疫中發(fā)揮什么作用、對(duì)其致病有什么生物學(xué)意義等問題尚不清楚。眾所周知,脂質(zhì)代謝參與細(xì)胞許多重要的生命活動(dòng),為各種細(xì)胞器形成、擴(kuò)展、收縮等動(dòng)態(tài)改變以及細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)降解等提供所需能量。而近年來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)還可以通過自噬體轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體進(jìn)行分解,此過程稱為脂噬作用。脂噬作為自噬的一種亞進(jìn)程,被報(bào)道與多種細(xì)菌、病毒等微生物的致病和感染密切相關(guān)。李倩博士2015年在Autophagy上曾報(bào)道過類鼻疽菌感染A549細(xì)胞早期,通過誘導(dǎo)MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的上調(diào),進(jìn)而實(shí)時(shí)、連續(xù)地抑制其靶基因ATG10表達(dá),負(fù)性調(diào)控自噬,從而影響宿主細(xì)胞的免疫清除,促進(jìn)其胞內(nèi)存活。那么,脂質(zhì)代謝的異常與類鼻疽菌感染引起的自噬過程受抑有什么關(guān)系呢?而類鼻疽菌是否是通過自噬作用調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,從而影響細(xì)菌在胞內(nèi)的增殖復(fù)制,并導(dǎo)致持續(xù)性感染的呢,仍有待闡明。為了探究類鼻疽菌感染過程中,自噬對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)控作用對(duì)類鼻疽菌胞內(nèi)生存的影響,我們首先建立了類鼻疽菌感染A549細(xì)胞模型,通過透射電鏡、Western Blot、激光共聚焦檢測(cè)了類鼻疽菌感染的A549細(xì)胞脂質(zhì)代謝和自噬水平變化情況,發(fā)現(xiàn)類鼻疽菌感染肺上皮細(xì)胞A549后脂質(zhì)嚴(yán)重蓄積,脂滴堆積,脂質(zhì)代謝關(guān)鍵分解酶活性降低;同時(shí)細(xì)胞內(nèi)AKT-mTOR自噬通路明顯受抑。其次,我們進(jìn)一步驗(yàn)證了自噬與脂質(zhì)代謝的關(guān)系。在藥物激活或抑制自噬、siRNA干擾等條件下,通過Western Blot、激光共聚焦觀察A549細(xì)胞脂質(zhì)代謝情況,發(fā)現(xiàn)激活自噬會(huì)明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝;細(xì)菌胞內(nèi)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞清除胞內(nèi)類鼻疽菌的能力明顯增強(qiáng)。接著,為了找尋類鼻疽菌是如何通過自噬調(diào)控脂質(zhì)代謝的線索,我們通過類鼻疽菌感染A549細(xì)胞后表達(dá)譜芯片的篩選,利用生物信息學(xué)分析軟件Cluster3.0和Tree View對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因進(jìn)行了聚類分析和預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)NR1D2mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。NR1D2(Nuclear receptor subfamily 1 group D member 2)是孤兒核受體家族成員,具有配體激活的功能。已有文獻(xiàn)報(bào)道NR1D2不僅能夠調(diào)節(jié)參與代謝功能的基因,如脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因,還能可以作為誘導(dǎo)自噬的重要信號(hào),與自噬信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白LC3、Beclin-1等相互作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬的調(diào)節(jié)。因此,為了探究在類鼻疽菌感染A549細(xì)胞過程中NR1D2是否介導(dǎo)自噬調(diào)節(jié)了脂質(zhì)代謝,我們首先利用RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)分析確證在類鼻疽菌感染A549細(xì)胞后NR1D2的表達(dá)水平明顯升高。其次,我們構(gòu)建了NR1D2干擾質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)類鼻疽菌感染宿主細(xì)胞后干擾NR1D2的表達(dá)明顯減少A549細(xì)胞中脂滴的蓄積,促進(jìn)宿主細(xì)胞脂質(zhì)代謝和β-氧化的速率;同時(shí)我們還觀察到自噬信號(hào)通路的關(guān)鍵分子LC3、Beclin-1也伴隨NR1D2的抑制而上調(diào)。進(jìn)一步,在抑制自噬水平的條件下,干擾NR1D2表達(dá),通過共聚焦實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即使干擾NR1D2的表達(dá),相比于對(duì)照組(control+DMSO)宿主細(xì)胞脂質(zhì)代謝水平也無明顯改變,表明在類鼻疽菌感染A549細(xì)胞進(jìn)程中,NR1D2介導(dǎo)了自噬調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝�？紤]到宿主脂質(zhì)代謝在病原感染進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,因此我們外源補(bǔ)充三醋酸甘油酯,促進(jìn)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝速率,通過細(xì)菌胞內(nèi)載量計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)表明激活宿主細(xì)胞脂質(zhì)代謝速率可以增強(qiáng)宿主細(xì)胞對(duì)類鼻疽菌的胞內(nèi)清除能力。綜上所述,本課題從脂質(zhì)代謝的角度探討了類鼻疽菌與宿主的相互作用在其感染致病中的意義,其創(chuàng)新性主要在于首次提出了“類鼻疽菌、脂噬、持續(xù)性感染”的作用模式。本文以脂噬為切入點(diǎn),初步闡明了類鼻疽菌感染宿主細(xì)胞后,誘導(dǎo)核受體因子NR1D2的表達(dá)上調(diào),干擾細(xì)胞自噬,導(dǎo)致宿主細(xì)胞脂質(zhì)蓄積,從而逃避宿主免疫清除而發(fā)生持續(xù)性感染。該研究一方面揭示了脂噬是如何在類鼻疽菌的胞內(nèi)持續(xù)性感染中發(fā)揮作用的機(jī)制,另一方面也為尋找抗類鼻疽感染的新方案提供理論依據(jù)和思路借鑒。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

Fig 1. The changes of lipid in A549 cells infected with B. pseudomallei. Representative TEMimages of uninfected (A) or A549 cells were infected by B. pseudomallei (B-D). B. pseudomallei infected A549cells (MOI=10:1) for 6 h, 12 h and 24 h, respectively. The scale bars are indicated. (E) Image J quantification ofthe number of lipid per cell in (A-D). (F) Image J quantification of the area of lipid per cell in (A-D). *p < 0.05,**p < 0.01.4.1.2 脂質(zhì)代謝成分檢測(cè)不同細(xì)胞中的脂質(zhì)體存在功能、外觀和組成上的差異，但最主要的成分是膽固醇和甘油三酯，為了進(jìn)一步證實(shí)類鼻疽菌感染后宿主細(xì)胞脂質(zhì)代謝的改變情況，我們進(jìn)行了多個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞脂質(zhì)形態(tài)和成分檢測(cè)。分別將類鼻疽菌感染A549 細(xì)胞 6 h、12 h、24 h 后的細(xì)胞樣品進(jìn)行共聚焦檢測(cè)和 ELISA 分析，結(jié)果表明：①類鼻疽菌感染宿主細(xì)胞后，經(jīng)過尼羅紅直接浸染細(xì)胞可以觀察到胞內(nèi)脂質(zhì)體數(shù)量隨著感染時(shí)間的延長明顯增多（圖 2A 和 2B）；②類鼻疽菌感染后，宿主細(xì)胞體內(nèi)脂質(zhì)成分膽固醇和甘油三酯含量隨著感染時(shí)間的延長明顯增加（圖 2C 和 2D）。

脂質(zhì)成分膽固醇含量。（D）檢測(cè)胞內(nèi)脂質(zhì)成分甘油三脂含量。es of lipid metabolism in A549 cells infected with B. pseudomalleiMOI=10:1) infected A549 cells for 6 h, 12 h and 24 h, respectively. (A)h laser confocal microscopy. Scale bars: 5 μm. (B) Quantitative analysis of t(A). (C) Detection of intracellular lipid cholesterol content. (D) Detection oftent. *p<0.05, **p<0.01.謝關(guān)鍵酶檢測(cè)含有大量具有多種生物學(xué)功能的蛋白酶，如環(huán)氧合酶， 合 成 酶 （ Fatty acid synthase, Fasn ） 和 脂 肪 分 解 酶ride lipase, ATGL）具有至關(guān)重要的作用。為此我們通過代謝關(guān)鍵酶變化，發(fā)現(xiàn)在不同的時(shí)間點(diǎn)，脂肪代謝合成酶表達(dá)明顯受抑（圖 3）。

類鼻疽菌感染 A549 細(xì)胞后自噬通路關(guān)鍵蛋白結(jié)果. B. pseudomallei inhibited autophagic pathway in A549 cells. B. pseudomallei infected A54MOI = 10:1) for 6 h, 12 h and 24 h. The expression of every protein was counted. 激活自噬有利于胞內(nèi)脂質(zhì)代謝脂噬作為一種重要的自噬亞進(jìn)程，在胞內(nèi)病原菌感染進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作因此，為了進(jìn)一步探究自噬在類鼻疽菌感染 A549 細(xì)胞脂質(zhì)代謝中的作用，分別采用不同的藥物預(yù)處理細(xì)胞。由于自噬體的形成依賴于多種自噬蛋白與，包括 ATG5、ATG7、ATG10 等，其中 ATG5 在自噬泡的形成中發(fā)揮重用，并參與調(diào)節(jié) LC3 向自噬泡的聚集導(dǎo)致自噬的發(fā)生，因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，處理組分別為使用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（Rapamycin, 200 nM）增強(qiáng)自噬，抑制劑 3-MA（3-methyladenine, 10 mM）和自噬沉默劑 ATG5 siRNA（100抑制自噬，通過激光共聚焦、Western Blot 等觀察類鼻疽菌感染 A549 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝情況。其中，自噬沉默劑 ATG5 siRNA 的沉默效率通過tern Blot 和 RT-PCR 來檢測(cè)（圖 5）。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陸振豸,張我東,莫卓壽,王永香,范翔九,梁家權(quán),歐陽新民;動(dòng)物體內(nèi)類鼻疽菌的分離[J];中國獸醫(yī)雜志;1984年02期

2 李瓊;李松;周甘平;蔡靜月;楊綺迪;;15例類鼻疽菌病例臨床用藥分析[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2008年06期

3 諸葛寶忠;朱德全;邱曉麗;馮尚彩;;類鼻疽伯克霍爾德菌感染臨床診斷與治療研究進(jìn)展[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2012年15期

4 劉(王子),趙建中,馬從林,甄英凱,鄧定華,李俐,端青;應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)對(duì)鼻疽菌和類鼻疽菌鑒別診斷的研究[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1987年04期

5 張我東,陸振豸,劉菊桃,趙春生,梁家權(quán),歐陽新民;某農(nóng)場(chǎng)豬類鼻疽的流行病學(xué)調(diào)查[J];獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1984年03期

6 韓藕兒;李俐;趙忠利;;類鼻疽菌血清分型[J];微生物學(xué)報(bào);1990年05期

7 端青,李俐;類鼻疽菌特異性抗原的制備與應(yīng)用—報(bào)道Ⅱ[J];中國人獸共患病雜志;1986年06期

8 胡藝;方瑤;毛旭虎;;類鼻疽伯克霍爾德菌胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白BimA的生物學(xué)特性研究進(jìn)展[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2016年03期

9 陸振豸;張我東;朱良其;梁家權(quán);劉菊桃;范翔九;;家畜類鼻疽疫源地調(diào)查[J];家畜傳染病;1983年02期

10 李俐，陸振豸，韓藕兒，張我東，趙忠利;我國類鼻疽流行病學(xué)調(diào)查[J];中華流行病學(xué)雜志;1994年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 方瑤;類鼻疽菌抑制巨噬細(xì)胞自噬逃逸清除的分子機(jī)制和流行病學(xué)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 唐夢(mèng)靈;NR1D2介導(dǎo)的脂噬在類鼻疽菌胞內(nèi)持續(xù)性感染中的作用機(jī)制研究[D];西南大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2852999