發(fā)布時(shí)間：2020-10-19 18:51

　　 剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)簡稱弓形蟲,是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲,它可以感染幾乎所有的溫血?jiǎng)游?包括人類),引發(fā)人獸共患弓形蟲病。免疫功能正常的個(gè)體感染弓形蟲后一般無明顯癥狀,或僅表現(xiàn)出輕微流感樣癥狀。孕婦在孕期感染弓形蟲,可對(duì)胎兒健康造成不良影響,可致流產(chǎn)、畸形、死胎等。弓形蟲病是最常見的機(jī)會(huì)性感染疾病,免疫功能低下的群體感染弓形蟲或可導(dǎo)致嚴(yán)重后果,如弓形蟲病占AIDS各種機(jī)會(huì)性感染的10%～30%,可引起腦部局灶性占位性病變。此外,弓形蟲病對(duì)畜牧業(yè)亦可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。弓形蟲主要有3種分泌細(xì)胞器,分別是微線體(microneme)、棒狀體(rhoptry)和致密顆粒(dense granule),三種細(xì)胞器分別產(chǎn)生微線體蛋白、棒狀體蛋白和致密顆粒蛋白。其中,致密顆粒蛋白對(duì)蟲體修飾納蟲空泡以及在細(xì)胞內(nèi)生存有重要作用。寄生蟲的膜上表達(dá)的弓形蟲GRA12(TgGRA12)與位于弓形蟲納蟲空泡中的膜狀納米管網(wǎng)(MNN)的形成相關(guān),而且TgGRA12在弓形蟲的速殖子和緩殖子中都可以表達(dá)。巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(MIP-1α),即CCL3,是一種炎性趨化因子,可以促進(jìn)Th1型細(xì)胞分化,誘導(dǎo)分泌更多的細(xì)胞因子,產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。MIP-1α作為基因佐劑在多種抗病毒DNA疫苗中都有報(bào)道,實(shí)驗(yàn)證明MIP-1α可增強(qiáng)疫苗的免疫效果。一直以來,DNA疫苗被認(rèn)為是預(yù)防弓形蟲感染的有前途的策略。在這項(xiàng)研究中,我們?cè)u(píng)估了基因佐劑MIP-1α聯(lián)合TgGRA12的DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果。目的:弓形蟲疫苗優(yōu)秀靶點(diǎn)需要在眾多候選蛋白中進(jìn)行選擇。對(duì)TgGRA12蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為該蛋白作為弓形蟲DNA疫苗的可能性提供理論依據(jù)。預(yù)測(cè)TgGRA12蛋白的基本特性,分析其潛在Th、B細(xì)胞抗原表位,并與經(jīng)典靶點(diǎn)SAG1進(jìn)行比較,確認(rèn)其作為新靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)。構(gòu)建真核表達(dá)載體,聯(lián)合基因佐劑MIP-1α免疫小鼠評(píng)估DNA疫苗的保護(hù)效果,為尋找新的弓形蟲疫苗靶點(diǎn)以及更有效的佐劑提供指導(dǎo)。方法:通過生物信息學(xué)分析的方法,利用DNASTAR和IEDB分析軟件分別預(yù)測(cè)TgGRA12蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、潛在B細(xì)胞表位以及Th細(xì)胞抗原表位,并與經(jīng)典靶點(diǎn)蛋白SAG1進(jìn)行比較。擴(kuò)增TgGRA12和MIP-1α的基因片段,以真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1為載體,構(gòu)建重組基因疫苗pBudCE4.1-TgGRA12(pBud-TgGRA12)以及重組基因佐劑pBudCE4.1-MIP-1α(pBud-MIP-1α),最后通過酶切和測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。將昆明小鼠隨機(jī)分為5組,分別為疫苗組(pBud-TgGRA12組)、佐劑組(pBud-MIP-1α組)、疫苗+佐劑組(pBud-TgGRA12+pBud-MIP-1α組,即pBud-TgGRA12+pBud-MIP-1α組)、空質(zhì)粒組(pBudCE4.1組)和空白對(duì)照組(PBS組)。小鼠每兩周免疫一次,共免疫三次,隨后檢測(cè)特異性IgG和細(xì)胞因子產(chǎn)物。用7.gondii RH菌株速殖子進(jìn)行攻擊并記錄存活時(shí)間以評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。結(jié)果:TgGRA12蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和潛在B細(xì)胞表位以及潛在Th細(xì)胞表位與SAG1蛋白相比皆有較明顯的優(yōu)勢(shì),這些分析結(jié)果為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。成功構(gòu)建DNA疫苗和基因佐劑后免疫小鼠評(píng)估免疫保護(hù)效果。與對(duì)照組(PBS組和pBudCE4.1組)相比,疫苗組小鼠產(chǎn)生顯著強(qiáng)烈的體液應(yīng)答和Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答,并且抗體和細(xì)胞因子的滴度顯著增加(P0.05)。與疫苗組相比,聯(lián)合注射pBud-MIP-1α顯著增強(qiáng)了體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答(P0.05)。生存實(shí)驗(yàn)表明,疫苗+佐劑組小鼠存活時(shí)間最長,與疫苗組或佐劑組相比,小鼠的存活時(shí)間顯著延長(P0.05)。單獨(dú)佐劑組不能產(chǎn)生有效的體液免疫保護(hù),但可以輔助DNA疫苗誘導(dǎo)更強(qiáng)的Th1型細(xì)胞分化。DNA疫苗誘導(dǎo)免疫保護(hù)的能力很強(qiáng),免疫的小鼠感染速殖子后的存活時(shí)間延長。結(jié)論:生物信息學(xué)分析結(jié)果表明TgGRA12具有良好的T、B細(xì)胞抗原表位,理論上是剛地弓形蟲DNA疫苗的有效靶點(diǎn)。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明TgGRA12能誘導(dǎo)良好的保護(hù)性免疫應(yīng)答,而DNA疫苗聯(lián)合基因佐劑免疫小鼠引發(fā)了最高水平的免疫保護(hù)效力,疫苗接種后的小鼠對(duì)弓形蟲強(qiáng)毒株感染產(chǎn)生較高水平的免疫保護(hù),因此TgGRA12蛋白是針對(duì)急性弓形蟲病的一種有前途的候選疫苗,MIP-1α作為基因佐劑可增強(qiáng)弓形蟲DNA疫苗的免疫效果,為尋找新型佐劑提供了更多選擇。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

結(jié)果如圖１所示，ＴｇＧＲＡ１２蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中ａ螺旋、ｐ折疊、（３轉(zhuǎn)角和無規(guī)??則卷曲分別有２０個(gè)、３１個(gè)、２２個(gè)和１３個(gè)，ＴｇＳＡＧｌ蛋白中上述二級(jí)結(jié)構(gòu)的數(shù)??量分別為１４個(gè)、１９個(gè)、１９個(gè)和１１個(gè)。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中Ｐ－轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷??曲處更易形成抗原表位，是決定蛋白質(zhì)抗原性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，ＴｇＧＲＡ１２蛋白的ｐ－??轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲都多于ＴｇＳＡＧｌ蛋白，表明ＴｇＧＲＡ１２具有良好的抗原性。??５Ｃ３１ｃ?｜?Ｉ?？?Ｉ?Ｉ?ｉｆ?Ｉ?１?Ｉ?｜?？?Ｉ?Ｉ?｜?Ｉ?｜??２０?４?０?６０?８０?１ＣＤ?１２０?１４０?１?６０?１８０?２００?２２Ｄ?２４０?２６０?２８０?３００?３２０?３４０?３６０?３８０?４〇〇?４２Ｄ??ａ?＿?ｔｍ?■?■?■?ｉ?＾?ｍｍ￣￣？－＾???ＴｇＧＲＡ１２?８??■￣ｍｉ??？－？?＾?畫?ｍ——ｍ－??ｔ?—ａ?ｂ?ｍｍ￣￣？?ａ?ｅ?ｉ?￣ｔｅ－ｉ－Ｍ?１?ｍ￣ｉ?？?＜?〇???Ｃ??１?１?１?□?Ｄ—０?□￣ＣＭ?Ｂ?□?Ｑ—Ｏ??Ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?ｉ?Ｉ??２０?４?０?６?０?８０?１?００?１?２０?１４０?１６０?１?８０?２００?２２０?２４０?２６０?２８０?３００??ａ?■?■＿ｉ＿＿Ｂ—ｍ?ｍｔ—ｍ?■￣ｉ?■?—■■■■■?１??ＴｇＳＡＧｌ?ａ?—Ｈ￣■?■?■?ＢＢ－Ｓ－ＯＨｉ?￣Ｂ－ｌ?■???了??■?Ｍ?１—ａ?１｜?Ｂ?Ｉ?■?■

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文ＤＦ膜放入二抗稀釋液中，５０？６０ｒｐｍ，室溫孵育２ｈ。??ＢＳＴ?洗膜，８０？９０ｒｐｍ，１５ｍｉｎｘ３?次。??明書將化學(xué)發(fā)光試劑Ａ＆Ｂ以１：１混勻配成顯影液，儀上平鋪一層ＰＥ保鮮膜（褶皺抻平），ＰＶＤＦ膜正液器將顯影液均勻滴加在ＰＶＤＦ膜上，關(guān)上抽屜，調(diào)ｇＧＲＡＩ?２目的基因片段??ｃＤＮＡ為模板擴(kuò)増ＴｇＧＲＡ１２基因片段，１％瓊脂糖３所示，可見一約１３１１ｂｐ的條帶，與預(yù)期大小一致。??Ｍ?１??

圖４：?ｐＢｕｄ－ＴｇＧＲＡ１２質(zhì)粒小量提取雙酶切鑒定圖Ｍ：?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；?１：?ｐＢｕｄ－ＴｇＧＲＡ１２?重組ｓｔｅｄ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐＢｕｄ－Ｔ
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