研究目的：γδT細胞是參與宿主固有免疫應答的主要效應細胞,是橋聯(lián)固有免疫和適應性免疫的橋梁。有研究報道,IL-17~+γδT能夠抑制調(diào)節(jié)性T細胞的增殖及功能。本研究利用TCRδ-/-小鼠探討沙眼衣原體小鼠肺炎癥中產(chǎn)生IL-17的γδT細胞對Treg細胞增殖的影響以及可能的作用機制,為γδT細胞與Treg細胞相互作用提供理論依據(jù),也為固有免疫和適應性免疫的相互調(diào)節(jié)增添新的內(nèi)容。研究方法：取6-δ周齡雌性WT(C57BL/6)和TCRδ~(-/-)(C57BL/6遺傳背景)小鼠,經(jīng)鼻吸入1×10~3 IFU沙眼衣原體小鼠肺炎菌株(Chlymydia muridarum, Cm),誘導小鼠沙眼衣原體肺炎。在感染的不同時間點處死小鼠,收集肺泡灌洗液,制備肺組織單個核細胞懸液,用熒光素標記的抗鼠CD3、γδT抗體染色,流式細胞儀檢測γδT的增殖利用細胞內(nèi)細胞因子染色技術(shù)檢測肺組織CD3~+γδT細胞及Vγ1和Vγ4γδT細胞亞群分泌IL一17水平；用ELISA方法檢測WT和TCRδ-/-小鼠肺泡灌洗液中IL-17含量,探討Cm呼吸道感染誘導的γδT細胞增殖及IL-17的產(chǎn)生。利用流式細胞術(shù)檢測WT和TCRδ-/-小鼠脾臟及肺組織CD4~+CD25~+T及CD25~+Foxp3~+T細胞水平,確定沙眼衣原體呼吸道感染誘導的Treg細胞的增殖；進一步利用RT-PCR技術(shù)探討WT和TCRδ-/-小鼠肺組織Treg細胞相應轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達以及與Treg細胞活化及功能相關(guān)的細胞因子IL-2、TGF-β和IL-10 mRNA表達水平改變,從而探討γδT細胞對Treg細胞增殖的影響以及可能的作用機制。實驗結(jié)果：經(jīng)鼻腔吸入一定劑量的Cm誘導小鼠沙眼衣原體肺炎及CD3~+γδT~+細胞在小鼠肺組織的增殖及產(chǎn)生大量IL-17。感染第1天CD3~+γδT~+細胞百分率即開始增高(*P0.05),于感染第7天達到高峰(***P0.001),隨后降低,到感染第10天基本下降到未感染水平；細胞內(nèi)細胞因子染色結(jié)果顯示Cm感染誘導γδT細胞在感染第一天既分泌大量的IL-17(**P0.01),至感染第三天達到高峰(***P0.001),至感染后第五天γδT細胞產(chǎn)生IL-17的水平已顯著降低(*P0.05)。進一步我們對小鼠肺組織存在的兩個重要的γδT細胞亞群Vγ1和Vγ4 IL-17的分泌進行了研究,結(jié)果顯示Cm感染小鼠肺組織Vγ1基本不分泌IL-17,而Vγ4則分泌大量的IL-17,尤其是在感染第3天(***P0.001)達到分泌高峰,隨后迅速降低,至感染第10天降低至基礎水平,其變化趨勢與γδT細胞分泌IL-17一致。另外,我們的結(jié)果還證實,γδT細胞是感染早期IL-17的主要來源,TCRδ-/-小鼠肺泡灌洗液BAL中IL-17水平顯著低于WT小鼠*P0.05)。Cm感染能夠誘導小鼠外周免疫器官及局部炎癥部位Treg細胞增殖。與WT小鼠比較,TCRδ-/-小鼠脾組織Treg細胞百分率在感染后第3天顯著升高(**p0.01),而感染第7天則顯著降低(**p0.01)；進一步肺組織中Treg相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA表達趨勢與脾臟Treg細胞的變化一致(*P0.05),提示在Cm感染的不同時間點,γδT細胞通過不同的途徑調(diào)節(jié)Treg細胞的增殖。進一步對其可能的調(diào)節(jié)機制進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),感染后第3天WT和TCR6-/-小鼠肺組織Treg細胞活化因子IL-2 mRNA僅微量表達,而感染后第7天IL-2 mRNA在兩組小鼠肺組織明顯表達,且TCRδ-/-小鼠明顯低于WT小鼠(**P0.01)。肺組織Treg細胞功能性細胞因子TGF-p和IL-10的PCR結(jié)果顯示感染第3天TCRδ-/-小鼠IL-10水平明顯高于WT小鼠*P0.05)而感染第7天IL-10分泌明顯降低(*P0.05),與Treg細胞增殖變化一致,而肺組織TGF-β mRNA表達在兩組小鼠未見明顯差異。結(jié)論：Cm呼吸道感染誘導小鼠肺組織γδT細胞增殖并在感染早期分泌大量的IL-17,γδT細胞是感染早期IL-17的主要來源,其中Vγ4是分泌IL-17的主要γδT細胞亞群。Cm感染能夠誘導小鼠外周免疫器官及局部炎癥部位Treg細胞增殖,在Cm呼吸道感染中存在著γδT細胞對Treg細胞的免疫調(diào)節(jié),但在感染的不同階段調(diào)節(jié)機制不同,感染早期,γδT細胞可能通過分泌大量的IL-17抑制Treg細胞增殖,至感染中期IL-2的大量產(chǎn)生,可能是通過IL-2/IL-2R途徑促進Treg細胞；在沙眼衣原體感染中,γδT細胞主要通過影響Treg細胞功能性細胞因子IL-10的表達介導Treg細胞的免疫抑制功能。
【學位單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：R374
【部分圖文】：

結(jié)果感染誘導 γδT 細胞增殖及產(chǎn)生大量的 IL-17 呼吸道感染誘導 γδ T 細胞在小鼠肺組織增殖T 細胞作為固有免疫細胞，在病原體入侵機體后可以是機體抗感染的第一道防線。我們用一定劑量的沙m）經(jīng)呼吸道感染 WT 小鼠誘導小鼠衣原體肺炎，在，制備肺組織單個核細胞，利用流式細胞術(shù)檢測 CD顯示，小鼠肺組織中 CD3+γδ+T 細胞百分率在沙眼衣始增多（*P<0.05），至感染第 7 天達到最高水平（*復到正常水平。結(jié)果提示，沙眼衣原體呼吸道感染誘小鼠肺組織增殖。

Cm 感染誘導小鼠肺組織 γδ T 細胞 IL-17 的分泌及肺泡灌洗液 IL-17 水平 A、B Secrection of IL-17 by γδ T cells after Cm infection in WT miceproduction of IL-17 in BAL of WT and TCRδ-/-mice. The results were premean ± SD, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.γ4 為 Cm 感染后主要分泌 IL-17 的 γδT 細胞亞群據(jù)γ鏈和δ鏈的不同，γδT 細胞分為多個亞群，其中 Vγ1 和 Vγ4亞群，二者在多種免疫應答中具有不同的調(diào)控作用[43]。為進一的來源，我們利用細胞內(nèi)細胞因子染色分別對 Cm 誘導的肺組織 泌 IL-17 水平進行測定。流式結(jié)果顯示，在疾病進程中 Vγ1 基本IL-17+ Vγ1 僅占全部 γδT 的 1%左右（圖 1.3A）；而 Vγ4 在未感染泌一定量的 IL-17(約 12.3%)，感染后第 1 天分泌量開始增高，第感染第10天基本恢復正常水平（圖1.3B、C *P<0.05，**P<0.01，***P 細胞分泌 IL-17 趨勢一致，結(jié)果提示，Vγ4 是沙眼衣原體呼吸道感

23.3 WT 小鼠在 Cm 感染后 Vγ1 和 Vγ4 分泌 IL-17 水平.3 Secrection of IL-17 by Vγ1 and Vγ4 T cells after Cm infection in WT mice. The were presented as mean ± SD, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.
【參考文獻】

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1 唐瑩瑩;喬賽;趙慧麗;王悅;劉騰麗;邢冬紅;張永慈;白虹;;沙眼衣原體小鼠肺炎株呼吸道感染誘導肺組織中性粒細胞浸潤及活化[J];中華微生物學和免疫學雜志;2014年12期

本文編號：2847322