肺炎鏈球菌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的高發(fā)病率和死亡率細(xì)菌性病原菌之一,能夠?qū)е聡?yán)重的敗血癥等侵襲性和非侵襲性疾病,是導(dǎo)致全球5歲以下兒童死亡的重要病原菌。由于疫苗覆蓋率不足、疫苗使用后期出現(xiàn)的血清型替代問(wèn)題以及對(duì)傳統(tǒng)抗生素耐藥性問(wèn)題的日益嚴(yán)重,目前臨床治療和預(yù)防肺炎鏈球菌感染面臨巨大的挑戰(zhàn),因此必須對(duì)新的藥物和疫苗進(jìn)行研究。膽堿結(jié)合蛋白(Choline binding proteins,CBP)是在肺炎鏈球菌及相關(guān)鏈球菌屬中發(fā)現(xiàn)的多肽家族,具有模塊化的結(jié)構(gòu):功能模塊(Functional module,FM)和膽堿結(jié)合模塊(Choline binding module,CBM),其通過(guò)非共價(jià)作用將蛋白質(zhì)錨定在細(xì)胞壁中存在的膽堿殘基上。肺炎鏈球菌CBP包括細(xì)胞壁水解酶,粘附素和其他毒力因子,它們對(duì)細(xì)菌活力和毒力起著重要的生理作用。噬菌體裂解酶是噬菌體編碼的特異水解肽聚糖的水解酶類,通過(guò)破壞細(xì)胞壁完整性釋放子代噬菌體顆粒。肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶都具有模塊化結(jié)構(gòu),即N端催化域和C端細(xì)胞壁結(jié)合域。肺炎鏈球菌編碼的裂解酶類不具有信號(hào)肽序列,其通過(guò)holin系統(tǒng)穿過(guò)質(zhì)膜以攻擊肽聚糖上底物。本研究對(duì)文獻(xiàn)已報(bào)道的肺炎鏈球菌裂解酶ClyJ、Cpl-1以及ClyR的協(xié)同殺菌效果進(jìn)行研究,其中ClyJ和Cpl-1具有典型的CBM結(jié)構(gòu)域。通過(guò)在體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn),探索不同裂解酶之間催化域、結(jié)合域以及催化域和結(jié)合域之間的協(xié)同作用,為裂解酶的聯(lián)合應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肺炎鏈球菌裂解酶ClyJ與Cpl-1之間存在明顯的協(xié)同效果,體內(nèi)體外都具有明顯的增強(qiáng)殺菌和提高小鼠保護(hù)效果的作用。同時(shí),對(duì)具有CBM結(jié)構(gòu)域的裂解酶進(jìn)行小鼠免疫實(shí)驗(yàn),初步結(jié)果顯示裂解酶具有較好的免疫保護(hù)效果。本研究的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了裂解酶聯(lián)合應(yīng)用體內(nèi)外殺菌的高效性,不僅可以降低細(xì)菌耐藥的形成,同時(shí)可以作為新的抗菌藥和候選疫苗。
【學(xué)位單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

血癥的主要血清型 [63]。20世紀(jì)90年代，肺炎鏈球菌抗性基因流行并在北歐、東歐、北美、南美以及亞洲等國(guó)家迅速傳播 [64]。來(lái)自法國(guó)的一項(xiàng)研究數(shù)據(jù)（如圖1.2所示），所有年齡段患者中19,266例侵襲性肺炎球菌分離株對(duì)青霉素和紅霉素的耐藥趨勢(shì)，這種趨勢(shì)在2005年之后有所下降，主要原因在于PCV7的使用對(duì)于耐藥菌株的形成和傳播有一定的預(yù)防效果[65]。另一研究表明，肺炎鏈球菌耐藥率依然呈逐年上升趨勢(shì)，其主要是由于非疫苗血清型耐藥菌株在近10年迅速增加，尤其是多耐藥菌19A[52]，這種現(xiàn)象被稱為血清替代現(xiàn)象，即非疫苗血清型逐漸成為主要致病菌。

肺炎鏈球菌及其裂解酶編碼的 CBP 模塊化結(jié)構(gòu)。藍(lán)色代表膽堿結(jié)合模塊（結(jié)合重復(fù)序列（CBR）；綠色表示非保守區(qū) CBRs；黃色表示 CW_bindi結(jié)合膽堿。CHAP：半胱氨酸，組氨酸依賴性酰胺水解酶/肽酶模塊；Lactof.白結(jié)合域；FH bind.：H結(jié)合因子結(jié)構(gòu)域；R1和R2：具有粘附素功能的結(jié)構(gòu) 1.3 Modular organization of host- and phage-encoded pneumococcal CBPs. Bepresent the choline-binding repeats (CBRs) which configure the choline-bindies (CBM). Non-consensus CBRs are shown in green. Yellow units represent reing to the CW_binding_1 PFAM family but unable to bind choline.Activities ral functional modules are shown: CHAP, cysteine, histidine-dependenthydrolase/peptidase module; Lactof. binding, lactoferrin-binding domain; FH bH-binding domain; R1 and R2, domains with adhesin functions[128]炎鏈球菌 CBPs 對(duì)于細(xì)菌生存和獨(dú)立具有重要的作用，且覆蓋所清型，因此是潛在的新型藥物靶標(biāo) [129]。作為新型藥物靶標(biāo)，C勢(shì)：1）CBPs 在所有肺炎鏈球菌血清型細(xì)胞壁表面都有發(fā)現(xiàn)，因

圖 3.1 本研究所涉及的裂解酶 SDS-PAGE 圖Figure 3.1 12% SDS-PAGE analysis of the proteins used in this study表 3.1 裂解酶 ClyJ、Cpl-1 及 ClyR 內(nèi)毒素含量Table 3.1 The endotoxin concentration of ClyJ, Cpl-1and ClyR裂解酶的分子解析ClyR、Cpl-1 結(jié)構(gòu)組成如圖 3.2 所示。ClyJ 與 ClyR 是本實(shí)驗(yàn)裂解酶，對(duì)肺炎鏈球菌有很好的殺菌活性。ClyJ 的催化域結(jié)xin concentrationL)ClyJCpl-1 ClyRremoval of endotoxin325 580 1430moval of endotoxin40 32 144
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