造血干細(xì)胞(hemopoietic stem cell,HSC)在組織內(nèi)并不是固定的細(xì)胞成員,而是作為一群原始的造血細(xì)胞被造血組織所包含,同時(shí)也能在造血組織及血液中生存。在生長到第二周的人類胚胎的卵黃囊內(nèi),造血干細(xì)胞就出現(xiàn)了,當(dāng)人類胚胎發(fā)育到第四周的時(shí)候,造血干細(xì)胞開始在胎肝中出現(xiàn)。當(dāng)孕婦懷孕達(dá)到五個(gè)月時(shí),幼體骨髓中的造血功能開始運(yùn)轉(zhuǎn),在人類出生后,骨髓就成為了造血干細(xì)胞存在的主要場(chǎng)所和主要來源地。根據(jù)造血干細(xì)胞來源地不同可將造血干細(xì)胞移植分為骨髓造血干細(xì)胞移植,臍血造血干細(xì)胞移植和外周血造血干細(xì)胞移植三個(gè)組別。沒有供者限制這一點(diǎn)就是使用自體臍帶血造血干細(xì)胞移植的最大優(yōu)點(diǎn),并且在移植過后,發(fā)生移植物抗宿主病的幾率非常小,免疫抑制劑的使用量也大幅減少,幾乎沒有出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥,并且費(fèi)用較低,因此很多用戶都選擇去儲(chǔ)存自體臍帶血。本文主要通過實(shí)驗(yàn)來研究造血干細(xì)胞在提取儲(chǔ)存過程中的各種影響因素。第一部分研究了臍帶血采集量和分離到的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。通過6%羥乙基淀粉密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞(MNC),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,臍帶血采集量與分離收集的MNC數(shù)量之間線性相關(guān),r=0.985,P0.0001。因此,在不對(duì)母嬰造成影響的前提下,盡量多的采集臍帶血可以增加收集分離的有MNC數(shù)量,進(jìn)而滿足移植的需要。第二部分主要研究臍帶血不同分離方法對(duì)造血干細(xì)胞分離效果的影響,本部分首先分析了Ficoll分層法、6%羥乙基淀粉密度梯度離心法和6%羥乙基淀粉自然沉降法三種方法分離臍帶血造血干細(xì)胞的效果,結(jié)果顯示,6%羥乙基淀粉密度梯度離心法分離得到的MNC數(shù)量最多,6%羥乙基淀粉自然沉降法次之,Ficoll分層法最低。對(duì)分離得到的MNC進(jìn)行半固體瓊脂培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)的CFU-GM集落數(shù)據(jù)顯示6%羥乙基淀粉密度梯度離心法要明顯高于其它兩種方法。同時(shí),本部分還對(duì)獲得的MNC中細(xì)胞表型進(jìn)行對(duì)比,與其他兩種方法相比,6%羥乙基淀粉密度梯度離心法會(huì)分離得到更多的CD3~+、CD14~+和CD34~+細(xì)胞。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,6%羥乙基淀粉密度梯度離心法是相對(duì)理想的臍帶血造血干細(xì)胞分離方法。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,多種因素會(huì)對(duì)6%羥乙基淀粉密度梯度離心法的分離效果造成影響。本研究利用響應(yīng)面法對(duì)離心溫度,離心力,離心時(shí)間三個(gè)影響因素進(jìn)行了分析優(yōu)化,最終得到在離心溫度15℃、離心力1000g及離心時(shí)間17.8min時(shí)分離效果最佳,此時(shí)分離的細(xì)胞活力可達(dá)到95.7%。第三部分主要研究不同的凍存方法對(duì)造血干細(xì)胞凍存質(zhì)量的影響。臍帶血造血干細(xì)胞低溫保存是臍帶血庫建設(shè)和臨床移植成功的前提條件。目前,慢速分步冷卻法是臍帶血干細(xì)胞保存的主流方法。在該方法中,降溫過程不同對(duì)復(fù)蘇后細(xì)胞活力影響很大。本研究選取降溫速率,降溫時(shí)間及降溫的終點(diǎn)溫度作為三因素探究最佳的降溫過程,響應(yīng)面法結(jié)果顯示,在降溫速率為1.5℃/min、降溫時(shí)間40h、降溫終點(diǎn)溫度為-80℃條件下,細(xì)胞復(fù)蘇后活力可達(dá)到98.7%。由于快速降溫,不產(chǎn)生冰晶和對(duì)細(xì)胞損傷小,玻璃化法在臍帶血造血干細(xì)胞的長期保存方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本論文對(duì)玻璃化法進(jìn)行了初步的研究。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,抗凍劑的種類和添加量,抗凍劑滴加速度以及滴加時(shí)的溫度都會(huì)對(duì)玻璃化法凍存的細(xì)胞活性產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)抗凍劑人血清白蛋白添加濃度,滴加速度和滴加溫度進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果顯示,在人血清白蛋白終濃度為17.1%、滴加溫度為-8.32℃、滴加速度為2.84%/min條件下進(jìn)行造血干細(xì)胞玻璃化凍存,最終細(xì)胞復(fù)蘇活力為99.1%。
【學(xué)位單位】：河北科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

子之間的關(guān)系與液態(tài)相比無明顯改變，因此可以避免該技術(shù)又被稱為無冰晶技術(shù)。目前，臍帶血造血干細(xì)方法。眾所周知，慢速凍存過程中，冰晶對(duì)細(xì)胞的損存時(shí)細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量，同時(shí)，慢速降溫所需要的程，最終增加了臍帶血保存的費(fèi)用和臍帶血庫的建設(shè)。超低溫保存方法，可以有效地克服慢速凍存法的缺點(diǎn)，優(yōu)點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞活性的保存具有較好的效果，在臍帶血現(xiàn)良好的應(yīng)用前景[40,41]。核形成和生長而結(jié)冰。但是如果由于某種原因未形成快而使晶核沒有足夠時(shí)間生長，就會(huì)出現(xiàn)溶液低于冰度叫過冷點(diǎn)（Th）。另一方面，如果溶液降溫速度足會(huì)形成，此時(shí)溶液就會(huì)進(jìn)入無定形的玻璃態(tài)，這是一時(shí)的溫度叫玻璃化形成溫度（Tg）。玻璃化轉(zhuǎn)變是一理論上，只要降溫速度足夠快，任何液體都可以進(jìn)入使降溫速度達(dá)到 107℃/s，但是這實(shí)際上不可能實(shí)現(xiàn)。問

第 2 章 臍帶血采集量與單個(gè)核細(xì)胞數(shù)的關(guān)系19圖2-1 臍帶血凍存程序降溫報(bào)告示意圖2.2 結(jié)果本次實(shí)驗(yàn)共采集嬰兒臍帶血 3436 人份，血量（93±22）ml 即（45~198）ml 不等，

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，利用 GraphPad Prism 軟件作圖（見圖 3-2），可以看出臍帶血采集量與分離收集的 MNC 數(shù)之間存在明顯的線性關(guān)系。圖2-2 臍帶血采集量與提取的MNC數(shù)之間的關(guān)系2.3 本章小結(jié)本實(shí)驗(yàn)采用 6%羥乙基淀粉密度梯度離心法分離 MNC 是本人十幾年工作的經(jīng)驗(yàn)積累，后面章節(jié)會(huì)有詳細(xì)論述。有文獻(xiàn)對(duì) 53 份臍帶血制備干細(xì)胞后進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)提取的單個(gè)核細(xì)胞含量隨臍帶血量增加而升高，兩者之間呈正相關(guān)（r = 0.82）[45]。本部分同樣對(duì)臍帶血采集量與 MNC 之間的關(guān)系進(jìn)行了分析。通過 6%羥乙基淀粉密度梯度離心法分離 MNC，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，臍帶血采集量與分離收集的 MNC 數(shù)量之間線性相關(guān)，r = 0.985，P< 0.0001。與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。因此，在不對(duì)母嬰造成影響的前提下
【參考文獻(xiàn)】

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