目的通過對(duì)致倦庫蚊溴氰菊酯敏感株和抗性株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,篩選可能與抗性相關(guān)的差異表達(dá)基因。方法對(duì)致倦庫蚊實(shí)驗(yàn)室敏感株(SS株)、海南株(HN株)和溴氰菊酯藥篩抗性株(RR株) 3個(gè)不同抗性水平的株系進(jìn)行生物測(cè)定,分別構(gòu)建3個(gè)株系的cDNA文庫,提取RNA,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序�；贔PKM值進(jìn)行差異性分析,對(duì)差異基因進(jìn)行GO和KEGG功能注釋與富集分析。篩選出致倦庫蚊不同株系中表達(dá)量有顯著性差異的基因,并采用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果生物測(cè)定結(jié)果顯示,與致倦庫蚊SS株相比,HN株和RR株的抗性倍數(shù)分別達(dá)到了4 828倍和197 241倍,為高等抗性水平。RNA-seq測(cè)序結(jié)果顯示,致倦庫蚊SS株、 HN株和RR株轉(zhuǎn)錄組共注釋基因轉(zhuǎn)錄本197 079個(gè)。GO富集分析結(jié)果顯示,在結(jié)合、催化活性、細(xì)胞過程、代謝過程、單一生物過程、細(xì)胞、細(xì)胞連接、細(xì)胞器中基因富集數(shù)量較多。KEGG富集分析結(jié)果顯示,在富集度最高的前20個(gè)條目中,RR株主要富集于剪接體、核糖體等通路,HN株則主要富集于剪切體、 RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、 hedgehog信號(hào)通路、細(xì)胞周期、核苷酸切除修復(fù)、 DNA復(fù)制等方向�；贔PKM值的差異性分析結(jié)果顯示,致倦庫蚊RR株和HN株較SS株均上調(diào)的有5 357個(gè),均下調(diào)的有10 978個(gè)。與溴氰菊酯抗性相關(guān)基因的靶向性篩選結(jié)果顯示,與SS株相比,RR株和HN株注釋的細(xì)胞色素P450基因、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因、氣味結(jié)合蛋白基因、氣味受體基因、視覺基因、核糖體蛋白基因和碳酸酐酶基因轉(zhuǎn)錄本中,均上調(diào)的分別為100、 17、 13、 4、 16、 191和1個(gè),均下調(diào)的分別為253、 48、 43、 4、 15、 504和9個(gè)。從上調(diào)基因中挑選的12個(gè)基因(2個(gè)細(xì)胞色素P450基因、 1個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因、 1個(gè)視覺基因、 1個(gè)核糖體蛋白基因、 1個(gè)碳酸酐酶基因、 1個(gè)核酸內(nèi)切酶基因、2個(gè)氣味結(jié)合蛋白基因、 3個(gè)氣味受體基因)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,在RR株和HN株中,這12個(gè)基因較SS株均顯著上調(diào),其中RR株較SS株上調(diào)1.62～80.26倍,HN株較SS株上調(diào)2.01～189.48倍。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,12個(gè)目標(biāo)基因的RNA-seq結(jié)果與實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果在HN株和RR株中均呈正相關(guān)(r=0.802、0.710)。證明這12個(gè)目標(biāo)基因的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致。結(jié)論基于高通量測(cè)序結(jié)果和定量PCR驗(yàn)證分析,致倦庫蚊中的某些細(xì)胞色素P450基因、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因、視覺基因、嗅覺蛋白基因可能在其對(duì)溴氰菊酯的抗性中起一定作用。
【部分圖文】：

2.8 RT-PCR對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證從2.6分析結(jié)果中選擇12個(gè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中上調(diào)的基因包括細(xì)胞色素P450基因（P45011A1、P4506B1）和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GSTD2等常見抗性基因，以及某些待驗(yàn)證的可能參與蚊蟲抗性的基因，如視覺基因opsin-1、CA基因、氣味結(jié)合蛋白（odorant-binding protein,OBP）基因（OBP45、PBP）、氣味受體（odor receptor,OR）基因（OR7a、OR10a、CPIJ006795）、核糖體蛋白（ribosomal protein S14p/S29e、SAE2）等，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證（圖3）。

與SS株相比，OBP45(CPIJ008158）和PBP(CPIJ019750）兩個(gè)嗅覺基因驗(yàn)證結(jié)果顯示，這兩個(gè)基因在HN株的表達(dá)量分別上調(diào)2.71和2.72倍（t=-6.240、-11.610，均P<0.01）；在RR株中，表達(dá)量分別上調(diào)2.79和1.95倍（t=-10.458,P<0.01;t=-3.490，均P<0.05）。圖3 致倦庫蚊3個(gè)不同株系的目標(biāo)基因差異性表達(dá)驗(yàn)證

圖2 致倦庫蚊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的KEGG顯著差異富集分析結(jié)果OR7a(CPIJ017139）、OR10a(CPIJ018787）和CPIJ006795基因3個(gè)OR基因驗(yàn)證結(jié)果顯示，在HN株中，這3個(gè)基因分別較SS株上調(diào)7.34、4.65、2.38倍（t=-5.287、P<0.01;t=-4.490、-5.480,P<0.05);RR株較SS株分別上調(diào)了2.41、4.65、2.92倍（t=-6.681、-7.569、-33.198，均P<0.01）。
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