發(fā)布時(shí)間：2020-10-13 09:23

　　 目的:通過對發(fā)育期暴露5-氮雜胞苷(5-Azaytidine,5-Aza)對成年期小鼠及其后代甲基化調(diào)控系統(tǒng)的影響研究,探討異常DNA甲基化模式的可遺傳性;并通過行為學(xué)試驗(yàn)研究具有焦慮抑郁樣行為母鼠的撫養(yǎng)對后代小鼠的影響,進(jìn)一步探討DNA甲基化模式遺傳性的穩(wěn)定性。方法:2周齡小鼠隨機(jī)分成2組,5-Aza組小鼠腹腔注射5-Aza,對照組給以等量鹽水。小鼠7-8周齡時(shí)進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn),行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后部分鼠處死取海馬進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),其余分組進(jìn)行交配:對照組雌鼠*對照組雄鼠(對照組)、5-Aza組雌鼠*對照組雄鼠(組二)、對照組雌鼠*5-Aza組雄鼠(組三)、5-Aza組雌鼠*5-Aza組雄鼠(組四)。所得小鼠待其成長至7?8周齡時(shí)進(jìn)行行為學(xué)試驗(yàn),然后處死,取海馬組織:用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測小鼠海馬中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase,Dnmt1)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(DNA methyltransferases3a,Dnmt3a)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(DNA methyltransferases 3b,Dnmt3b)、5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)、甲基化-CpG-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白1(Methyl-CpG-binding Domain protein 1,MBD1)、甲基化-CpG結(jié)合蛋白2(Methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)mRNA表達(dá)水平變化;ELISA法測定小鼠海馬中5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5mC)、5hmC表達(dá)水平;Western-Blot法檢測海馬中Dnmt1、Dnmt3a、MBD1、MeCP2蛋白表達(dá)水平。同時(shí),交換母鼠得到對照組雌鼠撫養(yǎng)組二幼仔組和5-Aza組雌鼠撫養(yǎng)對照組幼仔組,長至7?8周左右,進(jìn)行曠場試驗(yàn)、高架十字迷宮試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)、懸尾試驗(yàn)等行為學(xué)試驗(yàn)。結(jié)果:實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,發(fā)育期暴露于5-Aza的成年小鼠(F0)海馬中Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA表達(dá)水平與對照組相比下降(p0.05),其后代小鼠(F1)組二、組三、組四Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA在海馬中的表達(dá)水平較對照組下降(p0.05)。F0小鼠海馬中5hmC mRNA表達(dá)水平較對照組上升(p0.05),F1小鼠組二、組三、組四海馬中5hmC mRNA表達(dá)水平與對照組水平相比增加(p0.05)。F0小鼠海馬中MBD1、MeCP2 mRNA表達(dá)水平較對照組有所下降(p0.05),F1小鼠組二、組三、組四MBD1、MeCP2 mRNA在海馬中的表達(dá)水平較對照組減低(p0.05)。ELISA結(jié)果顯示,F0小鼠及F1小鼠組二、組三、組四海馬中5mC含量較對照組海馬中5mC的含量下降(p0.05),海馬中5mC含量較對照組有所減少(p0.05)。F0小鼠及其后代F1小鼠組二、組三、組四海馬中5hmC含量較對照組海馬中5hmC的含量上升(p0.05)。Western Blot結(jié)果表示,F0小鼠海馬中Dnmt1、Dnmt3a蛋白表達(dá)量與對照組相比降低(p0.05),F1小鼠組二、組三、組四海馬中Dnmt1、Dnmt3a蛋白表達(dá)量相比對照組有所下降(p0.05)。F0小鼠MBD1、MeCP2蛋白在海馬中的表達(dá)量下降(p0.05),F1小鼠組二、組三、組四海馬中MBD1、MeCP2蛋白表達(dá)量與對照組相比有所下降(p0.05)。曠場試驗(yàn)中,對照組雌鼠撫養(yǎng)組小鼠的站立次數(shù)、穿過中心區(qū)域的次數(shù)對照組減少(p0.05),處于中心區(qū)域的時(shí)間低于對照組(p0.01),而5-Aza組雌鼠撫養(yǎng)組小鼠的站立次數(shù)、穿過中心區(qū)域的次數(shù)、處于中心區(qū)域的時(shí)間與對照組相比無差異(p0.05)。在高架十字迷宮試驗(yàn)中,對照組雌鼠撫養(yǎng)組小鼠處于開臂時(shí)間的時(shí)間低于對照組(p0.01)。而5-Aza組雌鼠撫養(yǎng)組小鼠處于開臂時(shí)間的時(shí)間與對照組相比無差異(p0.05)。對照組雌鼠撫養(yǎng)組、5-Aza組雌鼠撫養(yǎng)組小鼠的站立次數(shù)與對照組相比無差異(p0.05)。在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中,對照組雌鼠撫養(yǎng)組小鼠在水中不動時(shí)間較對照組升高(p0.01),而5-Aza組雌鼠撫養(yǎng)組小鼠在水中不動時(shí)間與對照組相比無差異(p0.05)。在懸尾試驗(yàn)中,對照組雌鼠撫養(yǎng)組、5-Aza組雌鼠撫養(yǎng)組小鼠的不動時(shí)間與對照組相比無差異(p0.05)。結(jié)論:研究結(jié)果表明,發(fā)育期暴露于5-Aza的成年小鼠及其后代的DNA甲基化調(diào)控系統(tǒng)異常,并且這種異常可以遺傳至后代;具有焦慮抑郁樣行為的母鼠與正常雄鼠交配所生產(chǎn)的后代小鼠的焦慮抑郁狀態(tài)不被正常母親的撫養(yǎng)所改變,進(jìn)一步表明DNA甲基化的變化可穩(wěn)定遺傳的。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R394
【部分圖文】：

. 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法測定發(fā)育期暴露 5-aza 的成年小鼠（F0）及其后代（F1）海t1 mRNA 相對表達(dá)水平。圖 A、B 是 Dnmt1 的 qPCR 熔解曲線，圖 C、D 為發(fā)育-aza 的成年小鼠（F0）及其后代（F1）海馬中 Dnmt1 mRNA 相對表達(dá)水平。F1 代：組二：5-Aza 組雌鼠*對照組雄鼠，組三：對照組雌鼠*5-Aza 組雄鼠，組四：5-鼠*5-Aza 雄鼠。結(jié)果以 ±s 來表示。* p<0.05，** p<0.01 VS 對照組，（采用單因

. 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法測定發(fā)育期暴露 5-aza 的成年小鼠（F0）及其后代（F1）海t3a mRNA 相對表達(dá)水平。圖 A、B 是 Dnmt3a 的 qPCR 熔解曲線，圖 C、D 為發(fā) 5-aza 的成年小鼠（F0）及其后代（F1）海馬中 Dnmt3a mRNA 相對表達(dá)水平。F1下：組二：5-Aza 組雌鼠*對照組雄鼠，組三：對照組雌鼠*5-Aza 組雄鼠，組四：鼠*5-Aza 雄鼠。結(jié)果以 ±s 來表示。* p<0.05，** p<0.01 VS 對照組，（采用單因

. 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法測定發(fā)育期暴露 5-aza 的成年小鼠（F0）及其后代（F1）海t3b mRNA 相對表達(dá)水平。圖 A、B 是 Dnmt3b 的 qPCR 熔解曲線，圖 C、D 為發(fā) 5-aza 的成年小鼠（F0）及其后代（F1）海馬中 Dnmt3b mRNA 相對表達(dá)水平。F1下：組二：5-Aza 組雌鼠*對照組雄鼠，組三：對照組雌鼠*5-Aza 組雄鼠，組四：鼠*5-Aza 雄鼠。結(jié)果以 ±s 來表示。* p<0.05，** p<0.01 VS 對照組，（采用單因
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