瘧疾是由瘧原蟲引起的嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),2017年全球范圍內(nèi)共有2.19億瘧疾病例,有44.5萬(wàn)人死于瘧疾,且在2015年到2017年間瘧疾病例數(shù)輕微上升,瘧疾的全球防控仍然面臨著巨大挑戰(zhàn)。藥浸蚊帳、快速診斷試劑盒、以青蒿素為基礎(chǔ)的復(fù)方藥物等防治措施效果顯著,但按蚊對(duì)殺蟲劑出現(xiàn)抗性的現(xiàn)象加劇、青蒿素抗性蟲株的出現(xiàn)以及瘧疾疫苗的缺失使全球范圍內(nèi)瘧疾的防控形勢(shì)更加嚴(yán)峻。在五種可以感染人類的瘧原蟲中,惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)流行范圍廣泛,致病力最強(qiáng),危害最嚴(yán)重。惡性瘧原蟲的生活史具有宿主交替與世代交替的特點(diǎn),該蟲體經(jīng)按蚊傳播,在人的肝臟和紅細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無(wú)性生殖,在按蚊體內(nèi)進(jìn)行配子生殖和孢子生殖。蟲體在紅細(xì)胞內(nèi)寄生時(shí)期是瘧原蟲生存及致病的關(guān)鍵階段,而裂殖子入侵宿主紅細(xì)胞是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。更好地理解該時(shí)期蟲體與人體細(xì)胞的相互作用和分子機(jī)制對(duì)于揭示瘧原蟲致病機(jī)理及疫苗靶點(diǎn)等方面都是非常重要的�，F(xiàn)有的瘧疾疫苗在小動(dòng)物研究中多具有良好的保護(hù)效果,有的已經(jīng)完成三期臨床研究,但是有效率低、保護(hù)時(shí)間短、效果欠佳,目前原因尚不清楚。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),宿主針對(duì)高免疫原性裂殖子抗原產(chǎn)生的抗體不僅不具有保護(hù)性作用,反而能夠掩護(hù)關(guān)鍵的瘧原蟲功能性靶點(diǎn),甚至直接協(xié)助蟲體入侵紅細(xì)胞。而傳統(tǒng)的瘧疾疫苗候選抗原的篩選多基于血清學(xué)篩查高免疫原性抗原。因此開闊視角,開發(fā)新的瘧原蟲抗原,特別是功能性抗原,可能是打破瘧原蟲免疫耐受,制備切實(shí)有效的瘧疾疫苗的關(guān)鍵。發(fā)掘關(guān)鍵的瘧原蟲功能蛋白,需要對(duì)瘧原蟲基因表達(dá)規(guī)律進(jìn)行深入解析。惡性瘧原蟲3D7株核基因組由分布在14條染色體上的22.8兆堿基組成,共有大約5300個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因。據(jù)預(yù)測(cè),這些基因編碼的蛋白質(zhì)有60%是瘧原蟲獨(dú)有的。由于傳統(tǒng)基因研究方法在惡性瘧原蟲研究中耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、技術(shù)要求高,因此許多高通量方法用于研究基因功能信息。其中,基因表達(dá)譜分析已經(jīng)成為研究基因功能的重要手段。但是,現(xiàn)有的瘧原蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)多基于早期的基因組測(cè)序信息,數(shù)據(jù)不完整,很多基因沒(méi)有被包括在內(nèi),無(wú)法精準(zhǔn)展現(xiàn)瘧原蟲在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的基因轉(zhuǎn)錄規(guī)律,因此后期的研究無(wú)法直接采納相關(guān)數(shù)據(jù)。本課題承擔(dān)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程《重要寄生蟲病基礎(chǔ)與防治技術(shù)研究》部分研究任務(wù),采集高度同步化的蟲體,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)惡性瘧原蟲紅內(nèi)期6個(gè)關(guān)鍵生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間節(jié)點(diǎn)的蟲體進(jìn)行染色體基因精準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄分析,建立精準(zhǔn)而全面的惡性瘧原蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),利用該數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄組信息,分析瘧原蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中基因的表達(dá)規(guī)律,發(fā)掘入侵時(shí)期高表達(dá)的基因,繼而對(duì)惡性瘧原蟲入侵宿主紅細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選及功能研究。本課題收集入侵紅細(xì)胞后Oh、8h、16h、24h、32h和40h等6個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)育高度同步化的紅內(nèi)期蟲體,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)惡性瘧原蟲三號(hào)染色體243個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因和四號(hào)染色體246個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。之后經(jīng)過(guò)表達(dá)差異基因聚類分析,共發(fā)現(xiàn)63個(gè)基因在裂殖子期特異性高表達(dá)。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索及生物信息學(xué)分析,在三號(hào)染色體裂殖子期特異性高表達(dá)的基因中,4個(gè)基因?yàn)槲粗δ艿幕?采用原核表達(dá)純化技術(shù)制備了這四個(gè)蛋白的重組蛋白質(zhì)。在紅細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)重組蛋白質(zhì)P18和P187具有與紅細(xì)胞結(jié)合的能力,繼而進(jìn)行了深入研究。用免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)相應(yīng)蛋白質(zhì)的確在裂殖子期高表達(dá),免疫熒光實(shí)驗(yàn)獲得其在蟲體內(nèi)的細(xì)胞定位。在后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)重組蛋白質(zhì)的紅細(xì)胞結(jié)合作用均不受胰蛋白酶、乳糜蛋白酶、神經(jīng)氨酸酶的影響,表明這種結(jié)合與紅細(xì)胞表面的唾液酸殘基及血型糖蛋白A、B和C部分胞外區(qū)無(wú)關(guān)。轉(zhuǎn)染表達(dá)目的蛋白質(zhì)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞與紅細(xì)胞結(jié)合出現(xiàn)花環(huán)現(xiàn)象。肝素結(jié)合實(shí)驗(yàn)及結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)表明,重組蛋白質(zhì)可能與廣泛分布于紅細(xì)胞表面的肝素樣分子結(jié)合。這些結(jié)果提示這兩個(gè)蛋白質(zhì)可能在蟲體入侵紅細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用。體外入侵抑制實(shí)驗(yàn)表明,兩個(gè)蛋白質(zhì)的多克隆抗體血清能夠影響蟲體的增殖。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了蛋白質(zhì)P18和P187的抗原性,進(jìn)一步判斷其可能的細(xì)胞功能及潛在的抗瘧感染價(jià)值。綜上所述,本課題利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)惡性瘧原蟲第三、四號(hào)染色體編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行全面精準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,確定了相關(guān)基因在蟲體紅內(nèi)期表達(dá)的規(guī)律,為深入研究瘧原蟲紅內(nèi)期生長(zhǎng)發(fā)育及致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)篩選裂殖子入侵紅細(xì)胞時(shí)特異性高表達(dá)的基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)功能研究,為發(fā)現(xiàn)新的入侵相關(guān)蟲體抗原及潛在的疫苗候選抗原提供有價(jià)值的線索。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R382.31
【部分圖文】：

世衛(wèi)組織非洲區(qū)域仍然是瘧疾流行最嚴(yán)重的地區(qū)，瘧疾病例約為２億例，占全球病逡逑例總數(shù)的９２％，其次分別是世衛(wèi)組織東南亞區(qū)域（５％）和東地中海區(qū)域（２％）（見逡逑圖１）邋［４］。惡性瘧原蟲是世衛(wèi)組織非洲區(qū)域最流行的瘧疾寄生蟲，占２０１７年非洲區(qū)逡逑域估計(jì)瘧疾病例總數(shù)的９９．７％［火在全球范圍內(nèi)，約３．４％病例由間日瘧原蟲引起，逡逑其中５６％間日瘧病例發(fā)生于世衛(wèi)組織東南亞區(qū)域［４］。世衛(wèi)組織美洲區(qū)域的大部分瘧逡逑疾病例（７４％）是由間日瘧原蟲引起，而在東南亞區(qū)域和東地中海區(qū)域這一比例分逡逑別是３７％和３１％［４］。大約８０％瘧疾病例發(fā)生于非洲１５國(guó)和印度，其中，尼日利亞逡逑（２５％）、剛果民主共和國(guó)（１１％）、莫桑比克（５％）、印度（４％）和烏干達(dá)（４％）瘧疾負(fù)擔(dān)最逡逑為嚴(yán)重［４］。逡逑２０１０年至２０１７年，全球瘧疾發(fā)病率從每千人７２例降至５９例，但在過(guò)去３年逡逑中變化速度放緩，每千人風(fēng)險(xiǎn)人群瘧疾發(fā)病率停滯在５９例Ｉ４］。除了世衛(wèi)組織東南亞逡逑地區(qū)，瘧疾發(fā)病率一直變化平穩(wěn)，而在美洲地區(qū)有所增加，主要原因是巴西、尼加逡逑拉瓜和委內(nèi)瑞拉（玻利瓦爾共和國(guó)）發(fā)病率增加ｗ。２０１０年至２０１７年間，全球瘧疾逡逑死亡病例數(shù)從６０．７萬(wàn)例下降到４３．５萬(wàn)例

為實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，瘧原蟲經(jīng)歷了一系列不同的形態(tài)學(xué)階段，在特定的發(fā)育逡逑階段入侵不同的細(xì)胞［２３］，比如孢子體感染肝細(xì)胞、裂殖子入侵紅細(xì)胞、動(dòng)合子進(jìn)入逡逑蚊中腸上皮細(xì)胞等，而每一階段都有其各自的生物學(xué)特性（見圖２）。逡逑１３逡逑

圖１．３體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲在紅內(nèi)期各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)逡逑

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1 李?yuàn)檴?惡性瘧原蟲入侵關(guān)鍵蛋白質(zhì)P18和P187的發(fā)現(xiàn)及功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2019年

本文編號(hào)：2830559