瘧疾是由瘧原蟲引起的嚴重危害人類健康的寄生蟲病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,2017年全球范圍內(nèi)共有2.19億瘧疾病例,有44.5萬人死于瘧疾,且在2015年到2017年間瘧疾病例數(shù)輕微上升,瘧疾的全球防控仍然面臨著巨大挑戰(zhàn)。藥浸蚊帳、快速診斷試劑盒、以青蒿素為基礎(chǔ)的復(fù)方藥物等防治措施效果顯著,但按蚊對殺蟲劑出現(xiàn)抗性的現(xiàn)象加劇、青蒿素抗性蟲株的出現(xiàn)以及瘧疾疫苗的缺失使全球范圍內(nèi)瘧疾的防控形勢更加嚴峻。在五種可以感染人類的瘧原蟲中,惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)流行范圍廣泛,致病力最強,危害最嚴重。惡性瘧原蟲的生活史具有宿主交替與世代交替的特點,該蟲體經(jīng)按蚊傳播,在人的肝臟和紅細胞內(nèi)進行無性生殖,在按蚊體內(nèi)進行配子生殖和孢子生殖。蟲體在紅細胞內(nèi)寄生時期是瘧原蟲生存及致病的關(guān)鍵階段,而裂殖子入侵宿主紅細胞是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。更好地理解該時期蟲體與人體細胞的相互作用和分子機制對于揭示瘧原蟲致病機理及疫苗靶點等方面都是非常重要的�，F(xiàn)有的瘧疾疫苗在小動物研究中多具有良好的保護效果,有的已經(jīng)完成三期臨床研究,但是有效率低、保護時間短、效果欠佳,目前原因尚不清楚。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),宿主針對高免疫原性裂殖子抗原產(chǎn)生的抗體不僅不具有保護性作用,反而能夠掩護關(guān)鍵的瘧原蟲功能性靶點,甚至直接協(xié)助蟲體入侵紅細胞。而傳統(tǒng)的瘧疾疫苗候選抗原的篩選多基于血清學(xué)篩查高免疫原性抗原。因此開闊視角,開發(fā)新的瘧原蟲抗原,特別是功能性抗原,可能是打破瘧原蟲免疫耐受,制備切實有效的瘧疾疫苗的關(guān)鍵。發(fā)掘關(guān)鍵的瘧原蟲功能蛋白,需要對瘧原蟲基因表達規(guī)律進行深入解析。惡性瘧原蟲3D7株核基因組由分布在14條染色體上的22.8兆堿基組成,共有大約5300個編碼蛋白質(zhì)的基因。據(jù)預(yù)測,這些基因編碼的蛋白質(zhì)有60%是瘧原蟲獨有的。由于傳統(tǒng)基因研究方法在惡性瘧原蟲研究中耗時長、效率低、技術(shù)要求高,因此許多高通量方法用于研究基因功能信息。其中,基因表達譜分析已經(jīng)成為研究基因功能的重要手段。但是,現(xiàn)有的瘧原蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)多基于早期的基因組測序信息,數(shù)據(jù)不完整,很多基因沒有被包括在內(nèi),無法精準展現(xiàn)瘧原蟲在不同生長發(fā)育時期的基因轉(zhuǎn)錄規(guī)律,因此后期的研究無法直接采納相關(guān)數(shù)據(jù)。本課題承擔中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程《重要寄生蟲病基礎(chǔ)與防治技術(shù)研究》部分研究任務(wù),采集高度同步化的蟲體,采用實時熒光定量PCR對惡性瘧原蟲紅內(nèi)期6個關(guān)鍵生長發(fā)育時間節(jié)點的蟲體進行染色體基因精準轉(zhuǎn)錄分析,建立精準而全面的惡性瘧原蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,利用該數(shù)據(jù)庫的轉(zhuǎn)錄組信息,分析瘧原蟲生長發(fā)育過程中基因的表達規(guī)律,發(fā)掘入侵時期高表達的基因,繼而對惡性瘧原蟲入侵宿主紅細胞相關(guān)蛋白質(zhì)進行篩選及功能研究。本課題收集入侵紅細胞后Oh、8h、16h、24h、32h和40h等6個時間點發(fā)育高度同步化的紅內(nèi)期蟲體,使用實時熒光定量PCR法對惡性瘧原蟲三號染色體243個編碼蛋白質(zhì)的基因和四號染色體246個編碼蛋白質(zhì)的基因進行轉(zhuǎn)錄水平分析。之后經(jīng)過表達差異基因聚類分析,共發(fā)現(xiàn)63個基因在裂殖子期特異性高表達。經(jīng)過文獻檢索及生物信息學(xué)分析,在三號染色體裂殖子期特異性高表達的基因中,4個基因為未知功能的基因,采用原核表達純化技術(shù)制備了這四個蛋白的重組蛋白質(zhì)。在紅細胞結(jié)合實驗中,發(fā)現(xiàn)兩個重組蛋白質(zhì)P18和P187具有與紅細胞結(jié)合的能力,繼而進行了深入研究。用免疫印跡實驗證實相應(yīng)蛋白質(zhì)的確在裂殖子期高表達,免疫熒光實驗獲得其在蟲體內(nèi)的細胞定位。在后續(xù)功能實驗中,發(fā)現(xiàn)這兩個重組蛋白質(zhì)的紅細胞結(jié)合作用均不受胰蛋白酶、乳糜蛋白酶、神經(jīng)氨酸酶的影響,表明這種結(jié)合與紅細胞表面的唾液酸殘基及血型糖蛋白A、B和C部分胞外區(qū)無關(guān)。轉(zhuǎn)染表達目的蛋白質(zhì)的中國倉鼠卵巢細胞與紅細胞結(jié)合出現(xiàn)花環(huán)現(xiàn)象。肝素結(jié)合實驗及結(jié)合抑制實驗表明,重組蛋白質(zhì)可能與廣泛分布于紅細胞表面的肝素樣分子結(jié)合。這些結(jié)果提示這兩個蛋白質(zhì)可能在蟲體入侵紅細胞過程中發(fā)揮作用。體外入侵抑制實驗表明,兩個蛋白質(zhì)的多克隆抗體血清能夠影響蟲體的增殖。酶聯(lián)免疫吸附實驗進一步揭示了蛋白質(zhì)P18和P187的抗原性,進一步判斷其可能的細胞功能及潛在的抗瘧感染價值。綜上所述,本課題利用實時熒光定量PCR法對惡性瘧原蟲第三、四號染色體編碼蛋白質(zhì)的基因進行全面精準的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,確定了相關(guān)基因在蟲體紅內(nèi)期表達的規(guī)律,為深入研究瘧原蟲紅內(nèi)期生長發(fā)育及致病機理奠定了基礎(chǔ)。通過篩選裂殖子入侵紅細胞時特異性高表達的基因編碼的蛋白質(zhì)進行后續(xù)功能研究,為發(fā)現(xiàn)新的入侵相關(guān)蟲體抗原及潛在的疫苗候選抗原提供有價值的線索。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R382.31
【部分圖文】：

世衛(wèi)組織非洲區(qū)域仍然是瘧疾流行最嚴重的地區(qū)，瘧疾病例約為２億例，占全球病逡逑例總數(shù)的９２％，其次分別是世衛(wèi)組織東南亞區(qū)域（５％）和東地中海區(qū)域（２％）（見逡逑圖１）邋［４］。惡性瘧原蟲是世衛(wèi)組織非洲區(qū)域最流行的瘧疾寄生蟲，占２０１７年非洲區(qū)逡逑域估計瘧疾病例總數(shù)的９９．７％［火在全球范圍內(nèi)，約３．４％病例由間日瘧原蟲引起，逡逑其中５６％間日瘧病例發(fā)生于世衛(wèi)組織東南亞區(qū)域［４］。世衛(wèi)組織美洲區(qū)域的大部分瘧逡逑疾病例（７４％）是由間日瘧原蟲引起，而在東南亞區(qū)域和東地中海區(qū)域這一比例分逡逑別是３７％和３１％［４］。大約８０％瘧疾病例發(fā)生于非洲１５國和印度，其中，尼日利亞逡逑（２５％）、剛果民主共和國（１１％）、莫桑比克（５％）、印度（４％）和烏干達（４％）瘧疾負擔最逡逑為嚴重［４］。逡逑２０１０年至２０１７年，全球瘧疾發(fā)病率從每千人７２例降至５９例，但在過去３年逡逑中變化速度放緩，每千人風(fēng)險人群瘧疾發(fā)病率停滯在５９例Ｉ４］。除了世衛(wèi)組織東南亞逡逑地區(qū)，瘧疾發(fā)病率一直變化平穩(wěn)，而在美洲地區(qū)有所增加，主要原因是巴西、尼加逡逑拉瓜和委內(nèi)瑞拉（玻利瓦爾共和國）發(fā)病率增加ｗ。２０１０年至２０１７年間，全球瘧疾逡逑死亡病例數(shù)從６０．７萬例下降到４３．５萬例

為實現(xiàn)這一點，瘧原蟲經(jīng)歷了一系列不同的形態(tài)學(xué)階段，在特定的發(fā)育逡逑階段入侵不同的細胞［２３］，比如孢子體感染肝細胞、裂殖子入侵紅細胞、動合子進入逡逑蚊中腸上皮細胞等，而每一階段都有其各自的生物學(xué)特性（見圖２）。逡逑１３逡逑

圖１．３體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲在紅內(nèi)期各時間點的細胞形態(tài)逡逑

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李姍姍;惡性瘧原蟲入侵關(guān)鍵蛋白質(zhì)P18和P187的發(fā)現(xiàn)及功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2019年

本文編號：2830559