白念珠菌是臨床上最為重要的條件性致病真菌之一。由于免疫缺陷人群的不斷增加,白念珠菌引起的感染備受關(guān)注。在與宿主相互作用的過程中,白念珠菌進(jìn)化出極為精細(xì)的形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答系統(tǒng),能夠有效定殖并抵御宿主免疫系統(tǒng)攻擊。磷脂酰肌醇衍生物是真核細(xì)胞極為重要的一類小分子物質(zhì),與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長代謝調(diào)節(jié)緊密相關(guān)。在釀酒酵母及許多哺乳動物細(xì)胞中,磷脂酰肌醇磷酸酶Sac1及其同源蛋白介導(dǎo)了磷脂酰肌醇一磷酸或磷脂酰肌醇二磷酸向磷脂酰肌醇的轉(zhuǎn)化,在肌動蛋白組裝、細(xì)胞極性確立、細(xì)胞壁功能維持、胞吞與胞吐等過程中扮演重要角色。然而,白念珠菌的Sacl蛋白及其功能至今尚未明確。本研究即對白念珠菌的Sacl蛋白進(jìn)行分子鑒定及功能分析。主要結(jié)果如下：(1)通過BLASTP分析,從白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出一種與釀酒酵母ScSac1同源的蛋白,命名為Sacl。序列比對分析發(fā)現(xiàn),該蛋白屬于SAC家族成員,具有保守的CX5R(T/S)基序及SAC結(jié)構(gòu)域。通過構(gòu)建白念珠菌SAC1基因在釀酒酵母中的回補菌株,發(fā)現(xiàn)該基因能夠回補釀酒酵母ScSAC1缺失造成的肌醇營養(yǎng)缺陷,提示白念珠菌Sacl蛋白參與了磷脂酰肌醇代謝。通過GFP定位技術(shù),發(fā)現(xiàn)Sac1蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,提示該蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能緊密相關(guān)。(2)采用兩步PCR介導(dǎo)的同源重組法,構(gòu)建白念珠菌SAC1基因的缺失菌株,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建回補菌株。采用固體點板實驗,發(fā)現(xiàn)SAC1基因的缺失造成白念珠菌對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力及細(xì)胞壁壓力藥物高度敏感；酸性磷酸酶分析實驗表明,SAC1基因的缺失導(dǎo)致白念珠菌的糖基化能力發(fā)生缺陷；幾丁質(zhì)染色及透射電鏡觀察結(jié)果顯示,該基因缺失導(dǎo)致細(xì)胞壁幾丁質(zhì)分布與含量發(fā)生改變,以及細(xì)胞壁超顯微結(jié)構(gòu)異常；采用GFP報告系統(tǒng)及實時定量PCR技術(shù),發(fā)現(xiàn)該基因的缺失導(dǎo)致非折疊蛋白應(yīng)答(UPR)基因及細(xì)胞壁完整性(CWI)基因表達(dá)的上調(diào)。上述結(jié)果表明Sac1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞壁完整性維持方面發(fā)揮重要作用。(3)SAC1基因缺失導(dǎo)致白念珠菌菌絲發(fā)育能力降低,細(xì)胞僅能形成彎曲的菌絲,提示sac1Δ/Δ缺失株菌絲的極性生長能力受阻。肌動蛋白染色及Hwp1定位分析表明,SAC1基因缺失導(dǎo)致肌動蛋白斑在菌絲頂端的定位發(fā)生紊亂,以及菌絲特異性蛋白的極性轉(zhuǎn)運過程存在缺陷,表明Sacl通過維持肌動蛋白骨架的頂端定位,調(diào)控菌絲特異性蛋白的極性轉(zhuǎn)運過程。(4)SAC1基因缺失導(dǎo)致白念珠菌侵染宿主上皮細(xì)胞及耐受巨噬細(xì)胞攻擊的能力顯著下降,并且喪失了系統(tǒng)性感染小鼠的能力,表明Sac1與白念珠菌的毒力緊密相關(guān),是一種重要的毒力相關(guān)因子
【學(xué)位單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R379.4
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    第一節(jié) 白念珠菌的基本特性及致病性
    第二節(jié) 白念珠菌的形態(tài)發(fā)生
    第三節(jié) 白念珠菌的極性生長過程
        1.3.1 極性生長的概念及生物模型
        1.3.2 極性生長的調(diào)控
        1.3.3 白念珠菌極性生長的研究現(xiàn)狀
    第四節(jié) 磷脂酰肌醇磷酸酶Sac1的研究進(jìn)展
        1.4.1 磷脂酰肌醇磷酸代謝網(wǎng)絡(luò)的概述
        1.4.2 磷脂酰肌醇磷酸酶Sac1的生物學(xué)功能
        1.4.3 釀酒酵母Sac1的研究進(jìn)展
    第五節(jié) 選題依據(jù)及技術(shù)路線
        1.5.1 選題依據(jù)
        1.5.2 本研究的技術(shù)路線
第二章 材料與方法
    第一節(jié) 實驗材料
        2.1.1 實驗菌株
        2.1.2 質(zhì)粒
        2.1.3 引物
        2.1.4 實驗儀器
        2.1.5 實驗試劑
        2.1.6 培養(yǎng)基
        2.1.7 主要溶液
    第二節(jié) 實驗方法
        2.2.1 白念珠菌/釀酒酵母菌株的活化
        2.2.2 白念珠菌的轉(zhuǎn)化(醋酸鋰轉(zhuǎn)化法)
        2.2.3 釀酒酵母的轉(zhuǎn)化(醋酸鋰轉(zhuǎn)化法)
        2.2.4 白念珠菌/釀酒酵母基因組的提取
        2.2.5 白念珠菌SAC1基因的敲除
        2.2.6 PCR反應(yīng)體系及程序
        2.2.7 酶切體系
        2.2.8 DNA連接體系
        2.2.9 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.10 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化
        2.2.11 大腸桿菌質(zhì)粒的提取(堿裂解法)
        2.2.12 白念珠菌RNA的提取及純化、cDNA的獲得
        2.2.13 實時定量PCR(RT-PCR)
        2.2.14 白念珠菌總蛋白的提取(液氮研磨法)
        2.2.15 蛋白濃度的測定(考馬斯亮藍(lán)法)
        2.2.16 分泌型酸性磷酸酶(SAPs)糖基化水平的測定
        2.2.17 白念珠菌的菌絲誘導(dǎo)
        2.2.18 白念珠菌粘附能力的測定(聚苯乙烯孔板法)
        2.2.19 白念珠菌生物被膜形成能力測定
        2.2.20 白念珠菌壓力敏感性的測定(稀釋點板法)
        2.2.21 白念珠菌肌動蛋白細(xì)胞骨架的染色觀察
        2.2.22 白念珠菌細(xì)胞壁壓力敏感性的測定(物理振蕩壓力)
        2.2.23 白念珠菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)染色觀察及幾丁質(zhì)含量測定
        2.2.24 白念珠菌侵染上皮細(xì)胞能力的測定
        2.2.25 白念珠菌與巨噬細(xì)胞相互作用能力的測定
        2.2.26 小鼠系統(tǒng)性感染能力測定
第三章 結(jié)果與分析
    第一節(jié) 白念珠菌Sac1蛋白的鑒定
        3.1.1 白念珠菌Sac1蛋白序列及三維結(jié)構(gòu)分析
        3.1.2 白念珠菌SAC1基因缺失及回補菌株的構(gòu)建
        3.1.3 白念珠菌Sac1在釀酒酵母中功能的研究
        3.1.4 白念珠菌Sac1定位研究
    第二節(jié) SAC1基因的缺失對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的影響
        3.2.1 SAC1基因的缺失會增加白念珠菌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力敏感性
        3.2.2 SAC1基因的缺失對糖基化功能的影響
        3.2.3 SAC1基因的缺失導(dǎo)致細(xì)胞UPR途徑的激活
    第三節(jié) SAC1基因的缺失對細(xì)胞壁完整性的影響
        3.3.1 SAC1基因的缺失對細(xì)胞壁壓力敏感性的影響
        3.3.2 SAC1基因缺失對細(xì)胞壁幾丁質(zhì)分布及含量的影響
        3.3.3 SAC1基因缺失對細(xì)胞壁超顯微結(jié)構(gòu)的影響
        3.3.4 SAC1基因的缺失對基因表達(dá)的影響
    第四節(jié) SAC1基因的缺失對形態(tài)發(fā)生的影響
        3.4.1 SAC1基因的缺失對菌絲發(fā)育能力的影響
        3.4.2 SAC1基因的缺失對體外模擬與宿主相互作用能力的影響
        3.4.3 SAC1基因的缺失會造成極性相關(guān)成分定位的變化
    第五節(jié) Sac1在白念珠菌與宿主細(xì)胞相互作用中的功能
        3.5.1 SAC1基因的缺失對白念珠菌與巨噬細(xì)胞相互作用能力的影響
        3.5.2 SAC1基因缺失對白念珠菌侵染腸道上皮細(xì)胞能力的影響
        3.5.3 SAC1基因的缺失對白念珠菌系統(tǒng)性感染小鼠能力的影響
第四章 討論
    第一節(jié) 白念珠菌Sac1的序列與功能分析
    第二節(jié) Sac1與白念珠菌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能維持的關(guān)系
    第三節(jié) Sac1與白念珠菌細(xì)胞壁完整性的關(guān)系
    第四節(jié) Sac1與白念珠菌的極性生長
    第五節(jié) Sac1與白念珠菌的致病性
第五章 結(jié)論與展望
    第一節(jié) 結(jié)論
    第二節(jié) 論文的主要特色與創(chuàng)新點
    第三節(jié) 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡歷及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文

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