本文關(guān)鍵詞：抗圓環(huán)病毒Ⅱ型Cap蛋白納米抗體的生物素修飾及二聚化改造，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：駱駝和部分鯊魚(yú)體內(nèi)能產(chǎn)生天然缺失輕鏈的重鏈抗體,克隆重鏈可變區(qū)可以獲得只由VH組成的單域抗體,稱(chēng)之為納米抗體。納米抗體具有體積小、對(duì)環(huán)境的耐受性強(qiáng)、與抗原結(jié)合能力強(qiáng)及免疫原性低等特點(diǎn),因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上的診斷與治療。本實(shí)驗(yàn)室把PCV2病原免疫駱駝,收集外周血淋巴細(xì)胞建立酵母文庫(kù),并通過(guò)酵母雙雜交篩選,獲得了21株針對(duì)PCV2 Cap蛋白的納米抗體。通過(guò)原核表達(dá)及ELISA驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)有幾株納米抗體的活性?xún)?yōu)于商品化試劑盒里的血清。本研究基于以上基礎(chǔ),選取一株活性最好的納米抗體做進(jìn)一步的改造:通過(guò)一條柔性Linker的連接將此納米抗體同源二聚化;通過(guò)引入翻譯增強(qiáng)元件TEE來(lái)增強(qiáng)蛋白的表達(dá);通過(guò)在納米抗體的C端融合Avidin-tag,在表達(dá)生物素連接酶BirA的表達(dá)菌(外源添加bioin)中進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了二聚化納米抗體的生物素化。經(jīng)過(guò)上述修飾改造,納米抗體的活性得到了極大的提高。生物素-親和素系統(tǒng)是近年來(lái)廣泛應(yīng)用的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng);通過(guò)將抗體同源二聚化可以有效提高抗體結(jié)合抗原的能力;通過(guò)翻譯增強(qiáng)元件TEE可以進(jìn)一步提高外源蛋白原核表達(dá)的效率,從而降低抗體生產(chǎn)的成本。因此,本研究可以為PCV2的病原診斷ELISA試劑盒提供優(yōu)質(zhì)廉價(jià)抗體,有較大的應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：納米抗體 生物素 同源二聚體
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 文獻(xiàn)綜述9-22
• 第一章 納米抗體簡(jiǎn)介及大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展9-17
• 1.1 納米抗體簡(jiǎn)介9-14
• 1.1.1 納米抗體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)9-11
• 1.1.2 納米抗體的功能特性11-12
• 1.1.3 納米抗體的應(yīng)用12-14
• 1.2 大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的研究概況14-17
• 1.2.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因的優(yōu)缺點(diǎn)14-15
• 1.2.2 提高大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效可溶性表達(dá)外源蛋白的方法15-17
• 第二章 融合標(biāo)簽技術(shù)研究進(jìn)展17-22
• 2.1 融合標(biāo)簽的種類(lèi)17-18
• 2.2 融合標(biāo)簽的作用18-19
• 2.2.1 增加重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量18-19
• 2.2.2 提高蛋白的可溶性和穩(wěn)定性19
• 2.2.3 促進(jìn)蛋白正確折疊19
• 2.2.4 實(shí)現(xiàn)蛋白的特異性標(biāo)記19
• 2.2.5 在檢測(cè)方面的應(yīng)用19
• 2.3 生物素親和素系統(tǒng)（BAS系統(tǒng)）19-20
• 2.4 本論文的研究意義、主要內(nèi)容及技術(shù)路線20-22
• 2.4.1 研究意義20-21
• 2.4.2 主要內(nèi)容及技術(shù)路線21-22
• 試驗(yàn)研究22-36
• 第三章 抗圓環(huán)病毒II型Cap蛋白納米抗體的生物素修飾及二聚化改造22-35
• 3.1 材料22-25
• 3.1.1 PCV2 Cap蛋白、納米抗體、菌株、載體22-23
• 3.1.2 酶、純化樹(shù)脂、抗體23
• 3.1.3 主要藥品及試劑23
• 3.1.4 溶液配制23-25
• 3.1.5 主要儀器25
• 3.2 方法25-30
• 3.2.1 納米抗體表達(dá)載體的構(gòu)建25-26
• 3.2.2 重組納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá)及純化26
• 3.2.3 包涵體的提取26-27
• 3.2.4 蛋白透析27
• 3.2.5 PCV2 Cap蛋白的表達(dá)純化27-28
• 3.2.6 融合標(biāo)簽納米抗體和Cap蛋白量的測(cè)定28-29
• 3.2.7 間接ELISA檢測(cè)融合標(biāo)簽納米抗體抗原結(jié)合活性29
• 3.2.8 直接ELISA檢測(cè)重組納米抗體生物素標(biāo)記的效果29-30
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-34
• 3.3.1 PCV2 Cap的原核表達(dá)與純化30
• 3.3.2 生物素化納米抗體二聚體表達(dá)載體pNovoAvi-dVHH的構(gòu)建30-31
• 3.3.3 生物素化納米抗體二聚體的表達(dá)31-32
• 3.3.4 重組納米抗體包涵體的提取與純化32
• 3.3.5 重組納米抗體的ELISA功能驗(yàn)證32-33
• 3.3.6 重組納米抗體生物素標(biāo)記ELISA驗(yàn)證33-34
• 3.4 討論34-35
• 結(jié)論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 致謝39-40
• 作者簡(jiǎn)介40

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：281739