本文關鍵詞：抗圓環(huán)病毒Ⅱ型Cap蛋白納米抗體的生物素修飾及二聚化改造，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：駱駝和部分鯊魚體內能產生天然缺失輕鏈的重鏈抗體,克隆重鏈可變區(qū)可以獲得只由VH組成的單域抗體,稱之為納米抗體。納米抗體具有體積小、對環(huán)境的耐受性強、與抗原結合能力強及免疫原性低等特點,因此被廣泛應用于醫(yī)學上的診斷與治療。本實驗室把PCV2病原免疫駱駝,收集外周血淋巴細胞建立酵母文庫,并通過酵母雙雜交篩選,獲得了21株針對PCV2 Cap蛋白的納米抗體。通過原核表達及ELISA驗證,發(fā)現有幾株納米抗體的活性優(yōu)于商品化試劑盒里的血清。本研究基于以上基礎,選取一株活性最好的納米抗體做進一步的改造:通過一條柔性Linker的連接將此納米抗體同源二聚化;通過引入翻譯增強元件TEE來增強蛋白的表達;通過在納米抗體的C端融合Avidin-tag,在表達生物素連接酶BirA的表達菌(外源添加bioin)中進一步實現了二聚化納米抗體的生物素化。經過上述修飾改造,納米抗體的活性得到了極大的提高。生物素-親和素系統(tǒng)是近年來廣泛應用的信號級聯(lián)放大系統(tǒng);通過將抗體同源二聚化可以有效提高抗體結合抗原的能力;通過翻譯增強元件TEE可以進一步提高外源蛋白原核表達的效率,從而降低抗體生產的成本。因此,本研究可以為PCV2的病原診斷ELISA試劑盒提供優(yōu)質廉價抗體,有較大的應用價值。
【關鍵詞】：納米抗體 生物素 同源二聚體
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 文獻綜述9-22
• 第一章 納米抗體簡介及大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展9-17
• 1.1 納米抗體簡介9-14
• 1.1.1 納米抗體的結構特點9-11
• 1.1.2 納米抗體的功能特性11-12
• 1.1.3 納米抗體的應用12-14
• 1.2 大腸桿菌原核表達系統(tǒng)的研究概況14-17
• 1.2.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)表達外源基因的優(yōu)缺點14-15
• 1.2.2 提高大腸桿菌表達系統(tǒng)高效可溶性表達外源蛋白的方法15-17
• 第二章 融合標簽技術研究進展17-22
• 2.1 融合標簽的種類17-18
• 2.2 融合標簽的作用18-19
• 2.2.1 增加重組蛋白質的產量18-19
• 2.2.2 提高蛋白的可溶性和穩(wěn)定性19
• 2.2.3 促進蛋白正確折疊19
• 2.2.4 實現蛋白的特異性標記19
• 2.2.5 在檢測方面的應用19
• 2.3 生物素親和素系統(tǒng)（BAS系統(tǒng)）19-20
• 2.4 本論文的研究意義、主要內容及技術路線20-22
• 2.4.1 研究意義20-21
• 2.4.2 主要內容及技術路線21-22
• 試驗研究22-36
• 第三章 抗圓環(huán)病毒II型Cap蛋白納米抗體的生物素修飾及二聚化改造22-35
• 3.1 材料22-25
• 3.1.1 PCV2 Cap蛋白、納米抗體、菌株、載體22-23
• 3.1.2 酶、純化樹脂、抗體23
• 3.1.3 主要藥品及試劑23
• 3.1.4 溶液配制23-25
• 3.1.5 主要儀器25
• 3.2 方法25-30
• 3.2.1 納米抗體表達載體的構建25-26
• 3.2.2 重組納米抗體的誘導表達及純化26
• 3.2.3 包涵體的提取26-27
• 3.2.4 蛋白透析27
• 3.2.5 PCV2 Cap蛋白的表達純化27-28
• 3.2.6 融合標簽納米抗體和Cap蛋白量的測定28-29
• 3.2.7 間接ELISA檢測融合標簽納米抗體抗原結合活性29
• 3.2.8 直接ELISA檢測重組納米抗體生物素標記的效果29-30
• 3.3 實驗結果30-34
• 3.3.1 PCV2 Cap的原核表達與純化30
• 3.3.2 生物素化納米抗體二聚體表達載體pNovoAvi-dVHH的構建30-31
• 3.3.3 生物素化納米抗體二聚體的表達31-32
• 3.3.4 重組納米抗體包涵體的提取與純化32
• 3.3.5 重組納米抗體的ELISA功能驗證32-33
• 3.3.6 重組納米抗體生物素標記ELISA驗證33-34
• 3.4 討論34-35
• 結論35-36
• 參考文獻36-39
• 致謝39-40
• 作者簡介40

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