發(fā)布時(shí)間：2017-04-02 01:08

  本文關(guān)鍵詞：牛血紅蛋白單克隆抗體的制備及其檢測(cè)試劑盒研制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的制備抗牛血紅蛋白(bHb)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株,鑒定抗b Hb單克隆抗體(McAb)。建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法,以檢測(cè)疫苗生產(chǎn)中小牛血清輔料中bHb的含量。方法以新鮮牛全血為原料,提取和純化牛血紅蛋白(bHb),以其作為免疫原,免疫BALB/c小鼠,經(jīng)細(xì)胞融合方法,篩選、克隆雜交瘤細(xì)胞株,制備抗bHb單克隆抗體;間接ELISA法檢測(cè)McAb,免疫印跡鑒定McAb的特異性;用ProteinA親和層析柱純化單克隆抗體腹水中的抗bHb單克隆抗體,過(guò)碘酸鈉法對(duì)抗體進(jìn)行辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記。用不同株單抗分別作為包被相和檢測(cè)相抗體組裝試劑盒;優(yōu)化包被抗體的包被濃度、時(shí)間及酶標(biāo)抗體的工作濃度和時(shí)間;組裝成定量檢測(cè)bHb含量的雙抗體夾心ELISA試劑盒,對(duì)試劑盒的穩(wěn)定性、精密度和特異性及實(shí)際應(yīng)用做了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。結(jié)果用層析法提取出具有免疫活性的牛血紅蛋白;經(jīng)雜交瘤篩選技術(shù),獲得4株分泌特異性抗bHb單克隆抗體的雜交瘤:1A10,2A6,3F8和4C6,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期傳代和反復(fù)凍融,細(xì)胞株仍能穩(wěn)定表達(dá)特異性抗體。4株McAb腹水ELISA效價(jià)能達(dá)到1:106~1:108;4株單克隆抗體亞型為IgG1和IgG2a;相對(duì)親和力3F84C61A102A6;表位鑒定結(jié)果顯示4株McAb針對(duì)3個(gè)不同的抗原表位;以1A10和4C6作為包被抗體,3F8作為酶標(biāo)記抗體,建立雙抗體夾心ELISA方法,組裝的試劑盒具有良好的穩(wěn)定性、特異性和精密度,通過(guò)對(duì)疫苗生產(chǎn)中小牛血清輔料的檢測(cè),證明該ELISA試劑盒可以應(yīng)用于小牛血清中牛血紅蛋白含量的檢測(cè)。結(jié)論成功提取純化了牛血紅蛋白抗原,通過(guò)單抗雜交瘤技術(shù),制備出4株抗牛血紅蛋白單克隆抗體,建立了穩(wěn)定性好,特異性強(qiáng)的雙抗體夾心ELISA方法,可以用于疫苗生產(chǎn)中血清輔料中牛血紅蛋白含量的檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：血清輔料 牛血紅蛋白 單克隆抗體 ELISA
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第1章 前言10-15
• 1.1 血紅蛋白概述10-11
• 1.2 血紅蛋白代謝及應(yīng)用11-12
• 1.3. 單克隆抗體技術(shù)12-13
• 1.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)13
• 1.5 本課題的研究意義13-15
• 第2章 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容15-42
• 實(shí)驗(yàn)一 牛血紅蛋白的提取和純化15-17
• 1.1 材料和方法15-16
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑15
• 1.1.2 牛血紅蛋白的提取和純化15-16
• 1.1.3 提取牛血紅蛋白純度鑒定16
• 1.2 結(jié)果16-17
• 1.2.1 牛血紅蛋白提取方法的確定16
• 1.2.2 提取牛血紅蛋白的鑒定16-17
• 實(shí)驗(yàn)二 牛血紅蛋白單克隆抗體的制備及鑒定17-28
• 2.1. 材料17-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞17
• 2.1.2 主要試劑17
• 2.1.3 主要設(shè)備17-18
• 2.1.4 培養(yǎng)基18
• 2.2 方法18-23
• 2.2.1 動(dòng)物的選擇18
• 2.2.2 動(dòng)物免疫18
• 2.2.3 骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備18-19
• 2.2.4 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備19
• 2.2.5 免疫脾細(xì)胞懸液的制備19
• 2.2.6 細(xì)胞融合的步驟19-20
• 2.2.7 陽(yáng)性孔的篩選20
• 2.2.8 有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化20
• 2.2.9 雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性的分析20-21
• 2.2.10 腹水制備21
• 2.2.11 腹水及細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)的測(cè)定21
• 2.2.12 單克隆抗體的亞型分析21
• 2.2.13 Protein A-Sepharose CL-4B親合層析純化單克隆抗體21
• 2.2.14 單克隆抗體的相對(duì)親和力測(cè)定21-22
• 2.2.15 單克隆抗體識(shí)別表位分析22
• 2.2.16 單克隆抗體的特異性分析22-23
• 2.3 結(jié)果23-26
• 2.3.1 細(xì)胞融合及篩選23
• 2.3.2 雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性的分析23
• 2.3.3 腹水及培養(yǎng)上清效價(jià)的測(cè)定23
• 2.3.4 單克隆抗體的亞型分析23-24
• 2.3.5 單克隆抗體的純化24-25
• 2.3.6 單克隆抗體相對(duì)親和力測(cè)定結(jié)果25
• 2.3.7 單克隆抗體結(jié)合位點(diǎn)的分析25-26
• 2.4 討論26-28
• 2.4.1 動(dòng)物免疫26
• 2.4.2 細(xì)胞融合26-27
• 2.4.3 篩選和克隆化27
• 2.4.4 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇27-28
• 實(shí)驗(yàn)三 牛血紅蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒的組裝28-42
• 3.1. 方法28-31
• 3.1.1 酶標(biāo)反應(yīng)板均一性的測(cè)定28
• 3.1.2 抗牛血紅蛋白單克隆抗體的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記28-29
• 3.1.3 酶標(biāo)單克隆抗體反應(yīng)濃度的確定29
• 3.1.4 單克隆抗體包被濃度的確定29
• 3.1.5 單克隆抗體包被條件的確定29
• 3.1.6 封閉液的選擇29-30
• 3.1.7 封閉條件的確定30
• 3.1.8 酶標(biāo)單抗反應(yīng)時(shí)間的確定30
• 3.1.9 雙抗體夾心ELISA操作步驟30-31
• 3.1.10 特異性檢測(cè)31
• 3.1.11 穩(wěn)定性試驗(yàn)31
• 3.1.12 精密度31
• 3.1.13 試劑盒的應(yīng)用31
• 3.2. 結(jié)果31-39
• 3.2.1 酶標(biāo)反應(yīng)板均一性的測(cè)定31-32
• 3.2.2 抗牛血紅蛋白單克隆抗體的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記32
• 3.2.3 酶標(biāo)抗體反應(yīng)濃度的確定32-33
• 3.2.4 單抗包被濃度的確定33-34
• 3.2.5 包被條件的確定34-35
• 3.2.6 封閉液的選擇35
• 3.2.7 封閉條件的確定35-36
• 3.2.8 酶標(biāo)單抗反應(yīng)時(shí)間的確定36-37
• 3.2.9 特異性檢測(cè)37
• 3.2.10 穩(wěn)定性檢測(cè)37-38
• 3.2.11 精密度38-39
• 3.4. 討論39-42
• 3.4.1 固相載體39
• 3.4.2 包被39
• 3.4.3 包被蛋白質(zhì)39-40
• 3.4.4 酶結(jié)合物40
• 3.4.5 酶底物40
• 3.4.6 洗滌液與稀釋液40-41
• 3.4.7 結(jié)果判斷41-42
• 第3章 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-44
• 附錄44-48
• 致謝48

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：牛血紅蛋白單克隆抗體的制備及其檢測(cè)試劑盒研制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：281611