目的:多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ether,PBDEs)的發(fā)育神經(jīng)毒性已引起人們的廣泛關(guān)注,但其毒性作用機(jī)制尚未完全闡明。大量研究表明,PBDEs的神經(jīng)毒性與線粒體損傷密切相關(guān);本課題組前期研究顯示,一定劑量的2,2',4,4'-四溴聯(lián)苯醚(PBDE-47)可引起PC12細(xì)胞線粒體融合與分裂相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào),同時(shí)伴有線粒體膜電位及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平下降,凋亡水平增加,細(xì)胞存活率降低,但線粒體融合與分裂抑制在該毒性過(guò)程中扮演何種角色,尚不清楚。本研究旨在探討線粒體融合改變?cè)赑BDE-47致PC12細(xì)胞損傷中的作用,從而為進(jìn)一步闡明PBDEs的神經(jīng)毒性機(jī)制提供理論依據(jù)。方法:采用不同手段促進(jìn)PC12細(xì)胞的線粒體融合水平,包括以下兩個(gè)方面:(1)使用線粒體融合促進(jìn)劑M1促進(jìn)線粒體融合:將培養(yǎng)的PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、20μmol/L PBDE-47處理組、20μmol/L PBDE-47+5μmol/L M1聯(lián)合處理組、5μmol/L M1處理組;(2)構(gòu)建融合相關(guān)蛋白線粒體融合蛋白2(mitofusion 2,Mfn2)過(guò)表達(dá)腺病毒載體(Ad-Mfn2)促進(jìn)線粒體融合:將培養(yǎng)的PC12細(xì)胞分為空載腺病毒處理組(對(duì)照組)、PBDE-47+空載腺病毒處理組、PBDE-47+Ad-Mfn2處理組、Ad-Mfn2處理組。細(xì)胞處理24 h后,采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)各組線粒體融合相關(guān)蛋白線粒體融合蛋白1(mitofusion 1,Mfn1)、線粒體融合蛋白2(mitofusion 2,Mfn2)和分裂相關(guān)蛋白分裂蛋白1(fission 1,Fis1)、磷酸化動(dòng)力相關(guān)蛋白1(phosphorylation dynamin related protein 1(Serin616),~(ser616)p-Drp1)的表達(dá)水平;利用線粒體特異性的MitoTracker?Deep Red FM熒光探針標(biāo)記線粒體后,使用激光共聚焦顯微鏡觀察各處理組細(xì)胞線粒體形態(tài)改變;利用線粒體膜電位依賴性的JC-1熒光探針標(biāo)記線粒體后,使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)各處理組細(xì)胞JC-1探針紅綠熒光比例以評(píng)估線粒體膜電位的改變;通過(guò)ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各處理組細(xì)胞ATP水平;采用Western blotting技術(shù)和免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(active cysteine containing aspartate specific protease-3,active Caspase-3)的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)分布情況;采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測(cè)各處理組細(xì)胞存活率。結(jié)果:(1)Western blotting結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,單純PBDE-47處理組的Mfn1、Mfn2、~(ser616)p-Drp1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.05);與單純PBDE-47處理組相比,M1或Ad-Mfn2聯(lián)合PBDE-47處理組的Mfn1、Mfn2、~(ser616)p-Drp1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.05)。(2)共聚焦觀察線粒體形態(tài)結(jié)果顯示,對(duì)照組線粒體主要呈絲狀及長(zhǎng)管狀;與對(duì)照組相比,單純PBDE-47處理組點(diǎn)狀和圓球狀等片段化線粒體明顯增多;與單純PBDE-47處理組相比,M1或Ad-Mfn2聯(lián)合PBDE-47處理組異常線粒體明顯減少。(3)線粒體功能檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,單純PBDE-47處理組的線粒體膜電位和ATP水平明顯降低(P0.05);與單純PBDE-47處理組相比,M1或Ad-Mfn2聯(lián)合PBDE-47處理組線粒體膜電位和ATP水平明顯升高(P0.05)。(4)凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,單純PBDE-47處理組active Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.05);與單純PBDE-47處理組相比,M1或Ad-Mfn2聯(lián)合PBDE-47處理組active Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各處理組active Caspase-3熒光著色情況與上述蛋白表達(dá)情況相一致。(5)CCK-8結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,單純PBDE-47處理組PC12細(xì)胞存活率明顯降低(P0.05);與單純PBDE-47組相比,M1或Ad-Mfn2聯(lián)合PBDE-47處理組PC12細(xì)胞存活率明顯升高(P0.05)。結(jié)論:促進(jìn)線粒體融合可有效改善PBDE-47所致的神經(jīng)細(xì)胞線粒體形態(tài)和功能異常,減輕細(xì)胞凋亡,提升細(xì)胞存活。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文2 結(jié)果2.1 線粒體融合促進(jìn)劑 M1 減輕 PBDE-47 所致 PC12 細(xì)胞線粒體融合分裂抑制實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、20 μmol/L PBDE-47 處理組、20 μmol/L PBDE-47 + 5 μmol/LM1 聯(lián)合處理組、5 μmol/L M1 處理組。細(xì)胞處理 24 h 后，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，采用 Western blotting 法檢測(cè)線粒體融合分裂相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果如圖 1 所示，與對(duì)照組相比，20 μmol/L PBDE-47 處理組 Mfn1、Mfn2 及 Fis1、p-Drp1 的蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P < 0.05）；與 20 μmol/L PBDE-47 處理組相比，20 μmol/LPBDE-47 + 5 μmol/L M1 聯(lián)合處理組 Mfn1、Mfn2 及 Fis1、p-Drp1 的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P < 0.05），表明促進(jìn)線粒體融合可緩解 PBDE-47 對(duì) PC12 細(xì)胞線粒體融合分裂的抑制作用。

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文狀線粒體明顯減少，而點(diǎn)狀及圓球狀等片段化線粒體明顯增多。與 20 μmol/LPBDE-47 處理組相比，20 μmol/L PBDE-47 + 5 μmol/L M1 聯(lián)合處理組點(diǎn)狀及圓球狀等片段化線粒體明顯減少，表明促進(jìn)線粒體融合可以緩解 PBDE-47 所致 PC12細(xì)胞線粒體形態(tài)片段化改變。

圖 3 M1 對(duì) PBDE-47 致 PC12 細(xì)胞線粒體功能損傷的影響注：（A）線粒體膜電位 JC-1 熒光圖；（B）線粒體膜電位統(tǒng)計(jì)條圖；（C）ATP 水平統(tǒng)計(jì)條圖。與 Control 組相比，*P < 0.05；與 PBDE-47 組比，#P < 0.05。2.4 M1 減輕 PBDE-47 所致 PC12 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理同上。分別采用 Western blotting 技術(shù)和免疫熒光法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白active Caspase-3的表達(dá)水平及其在胞內(nèi)分布情況。結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，20 μmol/L PBDE-47 處理組 active Caspase-3 蛋白表達(dá)水平明顯增加（P < 0.05）；與 20 μmol/L PBDE-47 處理組相比，20 μmol/L PBDE-47 + 5 μmol/L M1聯(lián)合處理組 active Caspase-3 的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P < 0.05）。共聚焦結(jié)果也有相似發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組顯示 active Caspase-3 的綠色熒光聚集較少；與對(duì)照組相比，20 μmol/L PBDE-47 處理組細(xì)胞質(zhì)中綠色熒光明顯增強(qiáng)；與 20 μmol/L PBDE-47 處理組相比，20 μmol/L PBDE-47 + 5 μmol/L M1 聯(lián)合處理組綠色熒光明顯減少。這些結(jié)果表明，促進(jìn)線粒體融合可抑制 PBDE-47 引起的 PC12 細(xì)胞凋亡。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 丁舉靜;何成華;劉俐君;馬彥娜;張海彬;;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對(duì)BHK-21細(xì)胞的線粒體膜電位及Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2011年02期

2 張明;何衛(wèi)紅;何平;夏濤;陳學(xué)敏;王愛(ài)國(guó);;多溴聯(lián)苯醚對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響[J];中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志;2007年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 俞瑾;調(diào)控線粒體形態(tài)與功能恢復(fù)高糖狀態(tài)下七氟醚后處理心肌保護(hù)作用的機(jī)制研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 董理鑫;自噬在PBDE-47致PC12細(xì)胞線粒體損傷中的作用[D];華中科技大學(xué);2017年

本文編號(hào)：2810925