白藜蘆醇是一種天然存在的多酚類化合物,眾多研究結(jié)果表明,白藜蘆醇具有抗炎、抗腫瘤、心血管保護、保肝、神經(jīng)系統(tǒng)保護、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等多種藥理作用。也有研究結(jié)果確切表明白藜蘆醇對于多種皮膚病具有一定的預(yù)防或是治療作用。白藜蘆醇具有順式及反式兩種結(jié)構(gòu),反式結(jié)構(gòu)的生物學(xué)活性強于順式結(jié)構(gòu)。白藜蘆醇難溶于水,化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定,易被氧化分解；口服后在體內(nèi)迅速代謝,體內(nèi)生物利用度低,制約了其廣泛應(yīng)用。近幾年白藜蘆醇的劑型研究成為研究熱點,已有的關(guān)于白藜蘆醇的劑型研究報道包括脂質(zhì)體、納米乳、環(huán)糊精包合物、乳脂體、納米混懸液、微球、納米粒、水凝膠等。銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚疾病,主要組織病理特征包括：表皮內(nèi)細(xì)胞角化不全或是角化過度、真皮內(nèi)血管膨大扭曲、多種炎性細(xì)胞浸潤。銀屑病發(fā)病過程中涉及到多種細(xì)胞如：角質(zhì)形成細(xì)胞、T細(xì)胞及樹突細(xì)胞,其具體發(fā)病機制尚不清楚。在參與銀屑病發(fā)病的眾多細(xì)胞因子中,TNF-α具有很重要的作用。TNF-α能夠促進角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。臨床治療中,基于對抗TNF-α的生物制劑對于銀屑病有很好的治療效果。最近幾年來,咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型被越來越多地應(yīng)用。該模型中涉及到的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與多條參與人類銀屑病發(fā)病的信號通路相似。有研究者發(fā)現(xiàn),在咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣模型中,與氧化應(yīng)激系統(tǒng)有關(guān)的酶存在著異常的升高或降低。銀屑病患者體內(nèi)存在著脂類、蛋白質(zhì)以及DNA的氧化損傷。異常的抗氧化系統(tǒng)以及活性氧的增高可能是銀屑病發(fā)病機制中的關(guān)鍵因素�；钚匝�(reactive oxygen species, ROS)可作為第二信使參與調(diào)控MAPK/AP-1、NF-kB、JAK-STAT等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,而上述信號通路在銀屑病皮損處活化增強。這些通路活化后可觸發(fā)參與銀屑病發(fā)病的細(xì)胞對于細(xì)胞因子產(chǎn)生反應(yīng),使得一些炎癥因子、趨化因子表達(dá)增多,從而對細(xì)胞的增殖、分化產(chǎn)生影響。經(jīng)皮微透析技術(shù)被認(rèn)為是評價藥物在皮膚中吸收代謝的有效工具,該技術(shù)的組織損傷小,可在動物體進行實時、在線取樣,在藥物的經(jīng)皮藥代動力學(xué)研究方面顯示極強的發(fā)展前景。本課題的主要研究目的是從細(xì)胞水平探討白藜蘆醇對TNF-α誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖以及分泌Thl/Th2型細(xì)胞因子的影響。將白藜蘆醇制成脂質(zhì)體凝膠劑,以外用給藥方式考察白藜蘆醇對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型的治療作用及可能機制,并且對白藜蘆醇脂質(zhì)體凝膠經(jīng)皮給藥藥代動力學(xué)進行研究,為該化合物的進一步開發(fā)利用提供證據(jù)。本課題主要分四部分進行研究：第一部分：白藜蘆醇對TNF-α誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖以及分泌Th1/Th2型細(xì)胞因子的影響首先采用MTT法考察白藜蘆醇對TNF-α誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果表明白藜蘆醇對于細(xì)胞的增殖有抑制作用并且確定TNF-α的最佳作用濃度。采用ELISA檢測白藜蘆醇對TNF-α誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞分泌Th1/Th2型細(xì)胞因子的影響,結(jié)果顯示白藜蘆醇對于角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL-6及IL-8有抑制作用,對于IL-10則是有促進作用。體外細(xì)胞實驗的結(jié)果表明,白藜蘆醇能夠抑制角質(zhì)細(xì)胞過度增殖,影響Th1/Th2型細(xì)胞因子的分泌,其中對Thl型細(xì)胞因子(IL-6、IL-8)分泌有抑制作用,而對Th2型細(xì)胞因子(IL-10)分泌有促進作用。第二部分：白藜蘆醇脂質(zhì)體凝膠的制備及其體外透皮性能考察首先確定白藜蘆醇脂質(zhì)體的制備方法,進而通過正交設(shè)計確定最佳處方,優(yōu)化白藜蘆醇脂質(zhì)體的最佳制備工藝。本部分研究結(jié)果表明：采用薄膜分散法；大豆磷脂、膽固醇、白藜蘆醇質(zhì)量比為20：4：5；加入適量乙醇使之溶解,超聲l0min;40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑,使得大豆磷脂在瓶壁上形成一層均勻薄膜；加入適量PBS (pH7.4),旋轉(zhuǎn)30min,放置2h使其充分水合；冰浴條件下超聲30min,得到包封率較高的白藜蘆醇脂質(zhì)體。對制備工藝進行驗證,制備的5批樣品平均包封率為90.27%,其RSD為0.95%,結(jié)果表明該制備工藝條件穩(wěn)定可靠。將脂質(zhì)體制備成脂質(zhì)體凝膠,采用Franze擴散池考察白藜蘆醇脂質(zhì)體凝膠劑的體外透皮性能。體外釋藥結(jié)果表明：與白藜蘆醇普通凝膠相比,白藜蘆醇脂質(zhì)體凝膠的累積透過量及皮膚中的蓄積量均有顯著提高；白藜蘆醇脂質(zhì)體凝膠具有透皮吸收及緩釋的效果。脂質(zhì)體凝膠做為白藜蘆醇透皮吸收載體更有優(yōu)勢。第三部分：白藜蘆醇對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型的治療作用首先考察白藜蘆醇對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠耳部組織增厚及炎癥反應(yīng)的影響。參照臨床上的PASI評分表,對炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度進行評估,并且結(jié)合組織切片染色,更直觀地考察耳部組織表皮增生及炎癥反應(yīng)具體情況。結(jié)果表明咪喹莫特誘導(dǎo)組小鼠出現(xiàn)不同程度的紅腫、增厚、鱗屑類似于銀屑病病樣皮損。而經(jīng)白藜蘆醇治療后皮損癥狀得以明顯緩解；異常的組織形態(tài)變化趨于正常,角質(zhì)形成細(xì)胞增殖減緩,表皮內(nèi)角化不全的細(xì)胞減少;PASI積分顯著降低；炎性細(xì)胞浸潤程度降低。白藜蘆醇對于咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型有一定的治療作用。因為喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣模型與氧化應(yīng)激系統(tǒng)有關(guān)的酶系統(tǒng)之間存在在一些聯(lián)系,因此我們考察了白藜蘆醇對銀屑病小鼠模型皮膚組織中SOD活性以及MDA含量的影響。結(jié)果表明,經(jīng)咪喹莫特誘導(dǎo)后,小鼠耳部皮膚組織中SOD活性降低,而MDA含量增高；經(jīng)白藜蘆醇治療后,小鼠耳部皮膚組織中SOD活性及MDA含量能恢復(fù)趨于正常。表明白藜蘆醇對于銀屑病樣小鼠皮膚組織中異常的氧化應(yīng)激系統(tǒng)有糾正作用,這有可能是白藜蘆醇發(fā)揮治療作用的機制。第四部分：白藜蘆醇脂質(zhì)體凝膠經(jīng)皮給藥藥代動力學(xué)研究本部分的研究采用微透析(Microdialysis,MD)技術(shù)聯(lián)用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatograph,HPLC)測定白藜蘆醇經(jīng)皮給藥后皮膚中的濃度變化情況,對白藜蘆醇經(jīng)皮給藥的藥代動力學(xué)進行考察。白藜蘆醇為脂溶性化合物,脂溶性化合物的探針回收率較低,而對于探針回收率過低的化合物微透析技術(shù)不適用。因此,首先從提高探針回收率的角度對灌流液進行優(yōu)化,篩選出合適的灌流液,最終確定pH值為9的PBS作為灌流液�？疾炝肆魉賹Π邹继J醇的探針體內(nèi)體外回收率的影響,確定了灌流速度為2μl/min�？疾炝藵舛葘Π邹继J醇的探針體內(nèi)體外回收率的影響,結(jié)果表明濃度對于白藜蘆醇的探針體內(nèi)體外回收率沒有影響。對探針的體內(nèi)體外回收率穩(wěn)定性進行考察,結(jié)果顯示在取樣過程中探針的回收率基本保持一致。通過對影響探針回收率的主要因素以及探針穩(wěn)定性的考察,表明微透析技術(shù)可用于白藜蘆醇經(jīng)皮給藥后藥動學(xué)研究。SD大鼠局部給予(0.5g/100g)白藜蘆醇脂質(zhì)體凝膠或白藜蘆醇普通凝膠,于不同時間點進行微透析取樣,HPLC檢測透析液中白藜蘆醇的濃度。根據(jù)白藜蘆醇的探針體內(nèi)回收率推算出其在皮膚局部的實際濃度,得到白藜蘆醇兩種制劑經(jīng)皮給藥后皮膚內(nèi)藥時曲線。采用3P97藥代動力學(xué)軟件,以非房室模型分別處理白藜蘆醇脂質(zhì)體凝膠和普通凝膠皮膚內(nèi)藥物濃度-時間數(shù)據(jù),計算出藥代動力學(xué)參數(shù)。白藜蘆醇脂質(zhì)體凝膠的藥動學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、T1/2、AUC0-t、MRT分別為327.2±9.4 min、91.7±3.2ng.ml-1、 453.8±10.9 min、688323.6±2274.5ng.min.m-1、395.3±11.6 min。白藜蘆醇普通凝膠的藥動學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、T1/2.AUC0.t、MRT分別為290.8±8.2min、75.8±5.1ng.ml-1、 389.5±14.5 min、558455.2±3481.6 ng.min.m-1、368.5±14.1 min。結(jié)果表明白藜蘆醇脂質(zhì)體凝膠在皮膚內(nèi)的保留時間以及藥物濃度顯著高于普通凝膠劑,具有良好的緩釋效果。本研究從細(xì)胞水平及整體動物水平對白藜蘆醇治療銀屑病的機制及療效進行評估；首次制備了白藜蘆醇脂質(zhì)體凝膠,并且對其經(jīng)皮給藥后藥代動力學(xué)進行考察,為這一化合物今后的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R285.5;R-332
【部分圖文】：

表明送一制備工藝穩(wěn)定可靠。逡逑（五）Ｒｅｓ脂質(zhì)體凝膠的制備逡逑Ｒｅｓ脂質(zhì)體凝膠及普通凝膠，兩種凝膠劑的外觀如圖２－２所示。其中脂質(zhì)體凝膠劑逡逑由于處方中有大豆x鎦拇嬖冢暈⒂星郴粕黃脹杭廖咨�。辶x匣義賢跡玻插澹遙�；e侍迥杭埃遙澹篤脹哄義希疲椋玨澹玻插澹遙澹簀澹歟椋穡錚螅錚恚邋澹紓澹戾澹崠潁溴澹遙澹簀澹紓澹戾義希遙�；e侍迥禾逋饌鈣ば閱蕓疾戾義現(xiàn)侍迥杭捌脹禾逋饌鈣ち拷峁恚玻訃巴跡玻場Ｖ侍迥鶴櫚幕賈斟義細(xì)哂諂脹鶴椋黃し糝行罨模遙澹蠛浚鶴椋ǎ睿角晌罰澹保沖澹澹埃澹常駁�，脂质体凝辶x希常常義

本文編號：2810058