本文關鍵詞：結核分枝桿菌潛伏感染相關蛋白Rv3287c的制備及免疫學特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是第二大致死性感染性疾病的病原體,以呼吸道感染為主要途徑,一旦入侵宿主體內即很難被清除,并且由于缺乏準確、快速和有效的診斷手段及安全、有效的預防性疫苗,此病的防治仍然是我國需要解決的重大問題之一。據(jù)估計,世界人口三分之一有MTB的潛伏感染,5%~10%的感染者在今后的生命中將發(fā)展成活動性結核病,因此,對結核潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)進行有效防治至關重要。目前卡介苗(M.bovis Bacillus Calmette-Guérin,BCG)是預防TB的主要疫苗,但其免疫效果并不十分確定,并不能有效地預防LTBI發(fā)展為TB,因此針對潛伏感染的疫苗的開發(fā)對于TB的控制具有重要的意義。潛伏相關抗原在MTB潛伏感染期上調表達,有可能成為潛伏感染的標志物及針對潛伏感染者的潛伏感染疫苗。本研究應用生物信息學軟件分析MTB Rv3287c蛋白的抗原表位,了解其抗原性;應用分子克隆技術制備了Rv3287c重組蛋白,并研究其免疫原性。一、MTB Rv3287c蛋白抗原的表位預測、蛋白相關分析及其優(yōu)化:利用DNAStar軟件包中Protean軟件對Rv3287c氨基酸序列進行分析,采用包括二級結構、親水性、抗原性、可及性、柔韌性、電荷分布等多參數(shù)預測其二級結構及T細胞和B細胞抗原表位。利用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法和Net CTL在線遠程預測CTL表位。Rv3287c具有豐富的二級結構,含有較少潛在的B細胞抗原表位,主要位于1~20、78~88、112~130、137~145氨基酸殘基或其附近,這些區(qū)域基本上含有β轉角結構,抗原性、親水性、表面可能性和柔韌性指數(shù)都較高;含有較多潛在的T細胞表位,主要位于16~19、24~25、28~44、47~52、54~68、71~79、84~88、91~101、107~109、111~124、126~129、140~143氨基酸殘基或其附近。利用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法和Net CTL在線遠程預測CTL表位,SYFPEITHI的預測結果顯示Rv3287c蛋白抗原在HLA-A*0201、HLA-A*03和HLA-B7評分在18分以上分別有22個、19個和4個。BIMAS的預測結果顯示其在HLA-A*0201、HLA-A*03和HLA-B7評分在30分以上分別有4個、0個和3個。Net CTL的預測結果顯示其在HLA-A*0201、HLA-A*03和HLA-B7評分在0.75分以上分別有6個、1個和7個。根據(jù)大腸桿菌偏愛的密碼子對rv3287c堿基序列進行優(yōu)化。使用TMHMM軟件對蛋白進行跨膜預測,使用Signal P軟件2.0版進行信號肽分析,發(fā)現(xiàn)Rv3287c蛋白是一個無信號肽、不分泌的胞漿蛋白。二、MTB Rv3287c克隆、表達、純化:通過基因合成含puc57-rv3287c重組質粒的大腸桿菌基因工程菌,再用高純度質粒小提試劑盒提取質粒puc57-rv3287c,經(jīng)NheⅠ和Eco RⅠ雙酶切進行鑒定后,再大量回收rv3287c基因片段,與同樣經(jīng)NheⅠ和Eco RⅠ雙酶切的載體p ET30a在T4 DNA連接酶的作用下連接,連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞,涂板、挑選單克隆進行酶切鑒定及測序鑒定,鑒定正確后提取質粒,將該原核表達質粒命名為p ET30a-rv3287c。用IPTG誘導蛋白表達后,用固化鎳吸收色譜純化蛋白。結果顯示重組質粒p ET30a-rv3287c構建成功,測序結果正確。蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達,蛋白分子量約14.89k Da,純化得到目的蛋白。三、MTB Rv3287c重組蛋白免疫學特性的研究以增殖期蛋白(CFP10-ESAT6)為對照,建立以重組潛伏感染相關蛋白Rv3287c為抗原的ELISPOT方法,選取健康對照組128例、結核潛伏感染者63例、活動性肺結核病患者55例及非結核呼吸疾病患者48例四類人群,檢測分泌IFN-γ的效應T細胞斑點數(shù)(SFCs),比較其在不同人群中的差異,評價它們在抗結核潛伏感染細胞免疫應答中的作用。通過ELISA方法檢測其在健康對照組30例、結核潛伏感染組35例、活動性結核病組30例及非結核呼吸病組30例人群血清中特異的抗Rv3287c蛋白的抗體Ig G水平,并比較組間差異,了解其體液免疫反應狀況。以潛伏感染組效應T細胞SFCs為陽性組,以活動性結核病組SFCs為陰性組,繪制該潛伏相關抗原鑒別結核活動性感染與潛伏感染的ROC曲線,在特異度80%及90%兩個點取SFC的cut-off值,以此評價并且比較潛伏感染蛋白對結核活動性感染與潛伏感染的鑒別診斷效能。結果顯示:Rv3287c蛋白潛伏感染組的SFCs值高于健康對照組,但差異不明顯(p0.05),而潛伏感染組的SFCs值顯著高于活動性結核病組(p0.05),非結核呼吸疾病組顯著低于潛伏感染組及健康對照組(p0.05)。ELISA方法檢測結果顯示:潛伏感染重組蛋白Rv3287c在四組間特異的Ig G水平差異不顯著(p0.05)。ROC曲線結果:Rv3287c曲線下面積為0.727,在特異度為83%、cut-off值為6個斑點時,健康對照組的陽性率為41.4%,潛伏感染組為50.8%,活動性結核組為14.5%,非結核呼吸病組為29.2%;在特異度為91%、cut-off值為11個斑點時,健康對照組的陽性率為25%,潛伏感染組為38.1%,活動性結核組為7%,非結核呼吸病組為12.5%。綜上所述,通過生物信息學預測,MTB Rv3287c是一個T細胞抗原表位占優(yōu)勢的蛋白,B細胞抗原表位比T細胞抗原表位少,是一個無信號肽、不分泌的胞漿蛋白。本研究制備了Rv3287c蛋白,并且發(fā)現(xiàn)經(jīng)過密碼子優(yōu)化后蛋白更容易表達,且效率較高;發(fā)現(xiàn)Rv3287c可被結核潛伏感染人群識別,誘導其效應T細胞產(chǎn)生的免疫應答強于活動性結核病患者,也略強于健康對照組,但不能區(qū)分健康對照組和潛伏感染組;Rv3287c不誘導機體產(chǎn)生體液免疫應答。
【關鍵詞】：結核分枝桿菌 重組蛋白Rv3287c 抗原表位 克隆 酶聯(lián)免疫斑點實驗
【學位授予單位】：河北北方學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-15
• 前言15-16
• 材料和方法16-24
• 實驗方法24-36
• 結果36-43
• 附圖43-51
• 附表51-54
• 討論54-60
• 結論60-61
• 參考文獻61-64
• 綜述 結核分枝桿菌潛伏感染抗原 Rv0116c、Rv3287c、Rv3290c 研究進展64-71
• 參考文獻68-71
• 致謝71-72
• 個人簡歷72-73

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：結核分枝桿菌潛伏感染相關蛋白Rv3287c的制備及免疫學特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：280412