本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白R(shí)v3287c的制備及免疫學(xué)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)是第二大致死性感染性疾病的病原體,以呼吸道感染為主要途徑,一旦入侵宿主體內(nèi)即很難被清除,并且由于缺乏準(zhǔn)確、快速和有效的診斷手段及安全、有效的預(yù)防性疫苗,此病的防治仍然是我國(guó)需要解決的重大問(wèn)題之一。據(jù)估計(jì),世界人口三分之一有MTB的潛伏感染,5%~10%的感染者在今后的生命中將發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核病,因此,對(duì)結(jié)核潛伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)進(jìn)行有效防治至關(guān)重要。目前卡介苗(M.bovis Bacillus Calmette-Guérin,BCG)是預(yù)防TB的主要疫苗,但其免疫效果并不十分確定,并不能有效地預(yù)防LTBI發(fā)展為TB,因此針對(duì)潛伏感染的疫苗的開(kāi)發(fā)對(duì)于TB的控制具有重要的意義。潛伏相關(guān)抗原在MTB潛伏感染期上調(diào)表達(dá),有可能成為潛伏感染的標(biāo)志物及針對(duì)潛伏感染者的潛伏感染疫苗。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析MTB Rv3287c蛋白的抗原表位,了解其抗原性;應(yīng)用分子克隆技術(shù)制備了Rv3287c重組蛋白,并研究其免疫原性。一、MTB Rv3287c蛋白抗原的表位預(yù)測(cè)、蛋白相關(guān)分析及其優(yōu)化:利用DNAStar軟件包中Protean軟件對(duì)Rv3287c氨基酸序列進(jìn)行分析,采用包括二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、可及性、柔韌性、電荷分布等多參數(shù)預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)及T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位。利用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法和Net CTL在線遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)CTL表位。Rv3287c具有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu),含有較少潛在的B細(xì)胞抗原表位,主要位于1~20、78~88、112~130、137~145氨基酸殘基或其附近,這些區(qū)域基本上含有β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu),抗原性、親水性、表面可能性和柔韌性指數(shù)都較高;含有較多潛在的T細(xì)胞表位,主要位于16~19、24~25、28~44、47~52、54~68、71~79、84~88、91~101、107~109、111~124、126~129、140~143氨基酸殘基或其附近。利用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法和Net CTL在線遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)CTL表位,SYFPEITHI的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Rv3287c蛋白抗原在HLA-A*0201、HLA-A*03和HLA-B7評(píng)分在18分以上分別有22個(gè)、19個(gè)和4個(gè)。BIMAS的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其在HLA-A*0201、HLA-A*03和HLA-B7評(píng)分在30分以上分別有4個(gè)、0個(gè)和3個(gè)。Net CTL的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其在HLA-A*0201、HLA-A*03和HLA-B7評(píng)分在0.75分以上分別有6個(gè)、1個(gè)和7個(gè)。根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子對(duì)rv3287c堿基序列進(jìn)行優(yōu)化。使用TMHMM軟件對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜預(yù)測(cè),使用Signal P軟件2.0版進(jìn)行信號(hào)肽分析,發(fā)現(xiàn)Rv3287c蛋白是一個(gè)無(wú)信號(hào)肽、不分泌的胞漿蛋白。二、MTB Rv3287c克隆、表達(dá)、純化:通過(guò)基因合成含puc57-rv3287c重組質(zhì)粒的大腸桿菌基因工程菌,再用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒puc57-rv3287c,經(jīng)NheⅠ和Eco RⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定后,再大量回收rv3287c基因片段,與同樣經(jīng)NheⅠ和Eco RⅠ雙酶切的載體p ET30a在T4 DNA連接酶的作用下連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞,涂板、挑選單克隆進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序鑒定,鑒定正確后提取質(zhì)粒,將該原核表達(dá)質(zhì)粒命名為p ET30a-rv3287c。用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后,用固化鎳吸收色譜純化蛋白。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒p ET30a-rv3287c構(gòu)建成功,測(cè)序結(jié)果正確。蛋白在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá),蛋白分子量約14.89k Da,純化得到目的蛋白。三、MTB Rv3287c重組蛋白免疫學(xué)特性的研究以增殖期蛋白(CFP10-ESAT6)為對(duì)照,建立以重組潛伏感染相關(guān)蛋白R(shí)v3287c為抗原的ELISPOT方法,選取健康對(duì)照組128例、結(jié)核潛伏感染者63例、活動(dòng)性肺結(jié)核病患者55例及非結(jié)核呼吸疾病患者48例四類人群,檢測(cè)分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)(SFCs),比較其在不同人群中的差異,評(píng)價(jià)它們?cè)诳菇Y(jié)核潛伏感染細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用。通過(guò)ELISA方法檢測(cè)其在健康對(duì)照組30例、結(jié)核潛伏感染組35例、活動(dòng)性結(jié)核病組30例及非結(jié)核呼吸病組30例人群血清中特異的抗Rv3287c蛋白的抗體Ig G水平,并比較組間差異,了解其體液免疫反應(yīng)狀況。以潛伏感染組效應(yīng)T細(xì)胞SFCs為陽(yáng)性組,以活動(dòng)性結(jié)核病組SFCs為陰性組,繪制該潛伏相關(guān)抗原鑒別結(jié)核活動(dòng)性感染與潛伏感染的ROC曲線,在特異度80%及90%兩個(gè)點(diǎn)取SFC的cut-off值,以此評(píng)價(jià)并且比較潛伏感染蛋白對(duì)結(jié)核活動(dòng)性感染與潛伏感染的鑒別診斷效能。結(jié)果顯示:Rv3287c蛋白潛伏感染組的SFCs值高于健康對(duì)照組,但差異不明顯(p0.05),而潛伏感染組的SFCs值顯著高于活動(dòng)性結(jié)核病組(p0.05),非結(jié)核呼吸疾病組顯著低于潛伏感染組及健康對(duì)照組(p0.05)。ELISA方法檢測(cè)結(jié)果顯示:潛伏感染重組蛋白R(shí)v3287c在四組間特異的Ig G水平差異不顯著(p0.05)。ROC曲線結(jié)果:Rv3287c曲線下面積為0.727,在特異度為83%、cut-off值為6個(gè)斑點(diǎn)時(shí),健康對(duì)照組的陽(yáng)性率為41.4%,潛伏感染組為50.8%,活動(dòng)性結(jié)核組為14.5%,非結(jié)核呼吸病組為29.2%;在特異度為91%、cut-off值為11個(gè)斑點(diǎn)時(shí),健康對(duì)照組的陽(yáng)性率為25%,潛伏感染組為38.1%,活動(dòng)性結(jié)核組為7%,非結(jié)核呼吸病組為12.5%。綜上所述,通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè),MTB Rv3287c是一個(gè)T細(xì)胞抗原表位占優(yōu)勢(shì)的蛋白,B細(xì)胞抗原表位比T細(xì)胞抗原表位少,是一個(gè)無(wú)信號(hào)肽、不分泌的胞漿蛋白。本研究制備了Rv3287c蛋白,并且發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后蛋白更容易表達(dá),且效率較高;發(fā)現(xiàn)Rv3287c可被結(jié)核潛伏感染人群識(shí)別,誘導(dǎo)其效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答強(qiáng)于活動(dòng)性結(jié)核病患者,也略強(qiáng)于健康對(duì)照組,但不能區(qū)分健康對(duì)照組和潛伏感染組;Rv3287c不誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 重組蛋白R(shí)v3287c 抗原表位 克隆 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-15
• 前言15-16
• 材料和方法16-24
• 實(shí)驗(yàn)方法24-36
• 結(jié)果36-43
• 附圖43-51
• 附表51-54
• 討論54-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 綜述 結(jié)核分枝桿菌潛伏感染抗原 Rv0116c、Rv3287c、Rv3290c 研究進(jìn)展64-71
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 致謝71-72
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷72-73

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白R(shí)v3287c的制備及免疫學(xué)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：280412