【摘要】：人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)是一種非節(jié)段性、單股負(fù)鏈RNA包膜病毒,屬于肺病毒科。RSV是導(dǎo)致嬰幼兒和老年人呼吸道疾病的主要病毒病原,每年造成3千多萬(wàn)5歲以下兒童嚴(yán)重下呼吸道感染、6萬(wàn)多名兒童死亡。RSV被發(fā)現(xiàn)至今已有60多年,但到目前為止,仍然沒有一種可用于預(yù)防病毒感染的有效疫苗。二十世紀(jì)六十年代,福爾馬林滅活的病毒(formalin-inactivated RSV,FI-RSV)輔以鋁佐劑的疫苗首先被用于嬰幼兒RSV疫苗的研究。不幸的是,這種疫苗導(dǎo)致了接種嬰幼兒嚴(yán)重的呼吸道疾病增強(qiáng)作用(enhanced respiratory disease,ERD)及極高的住院率,兩名兒童因細(xì)支氣管單核細(xì)胞浸潤(rùn)和嗜酸性粒細(xì)胞增多而死亡。FI-RSV導(dǎo)致ERD的原因有兩個(gè),一方面是中和抗體活性偏低,不能有效中和病毒;另一方面是疫苗誘導(dǎo)的Th2偏向的免疫應(yīng)答在攻毒后可導(dǎo)致嚴(yán)重的肺部炎癥。中和抗體活性偏低主要是由于FI-RSV表面缺失融合前F表位所致,而Th2偏向性免疫應(yīng)答則是福爾馬林滅活的病毒疫苗的特性之一。因此,安全有效、可用于嬰幼兒的RSV候選疫苗應(yīng)同時(shí)具有很好的中和活性以及誘導(dǎo)Th1偏向的免疫應(yīng)答。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)和主要內(nèi)容總結(jié)如下:第一,CpG-C插入到質(zhì)粒中能提高RSV DNA疫苗的免疫原性和保護(hù)性免疫應(yīng)答,同時(shí)還具有Th1偏向的特點(diǎn),可用于研發(fā)以嬰幼兒為目標(biāo)人群的RSV疫苗。本項(xiàng)研究中,我們對(duì)嵌入型CpG-C提高RSV DNA疫苗免疫原性的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。分別將5拷貝和20拷貝的CpG-C基序插入到攜帶有RSV F基因的質(zhì)粒中,免疫小鼠后,我們發(fā)現(xiàn),插入CpG-C基序能夠使DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生更高的血清抗體及中和抗體,同時(shí)能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的Th1偏向的免疫應(yīng)答。在保護(hù)免疫小鼠抵抗病毒感染、降低肺組織病理和病毒復(fù)制、以及減輕體重下降等方面,插入20拷貝CpG-C序列的RSV DNA疫苗更加有效。第二,在F蛋白成熟的過(guò)程中,其F0前體被切割為兩個(gè)亞單位和一個(gè)多肽片段后(F1、F2亞單位和27個(gè)氨基酸的多肽片段P27),P27被認(rèn)為是非必要的短肽而被釋放。為嘗試獲得融合前構(gòu)象的F蛋白,我們將P27滯留在F2的C末端(命名為M1-F),結(jié)果證明,這樣的改造具有穩(wěn)定Pre-F結(jié)構(gòu)的作用,與野生型F蛋白(F)相比,表達(dá)量沒有下降,但M1-F在293T細(xì)胞中表達(dá)的融合前表位卻顯著高于F。本項(xiàng)研究中,我們通過(guò)突變位于F0前體的兩個(gè)弗林酶切割位點(diǎn),研究對(duì)F蛋白構(gòu)象的影響。結(jié)果顯示,無(wú)論是下游切割位點(diǎn)Ⅱ的單獨(dú)突變(M2-F)還是聯(lián)合上游切割位點(diǎn)Ⅰ的突變(U-F)均導(dǎo)致了相應(yīng)突變的F蛋白M2-F和U-F表達(dá)量的急劇下降。而單一突變切割位點(diǎn)Ⅰ(M1-F),對(duì)蛋白的表達(dá)量并沒有影響。同時(shí),與F相比,在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面,M1-F有更多的融合前表位。第三,為維持融合前M1-F蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,我們?cè)O(shè)計(jì)、構(gòu)建了一系列基于M1-F的突變體。經(jīng)篩查,我們發(fā)現(xiàn)了能高效表達(dá)并且具有較高熱穩(wěn)定性的M1-F-1的突變體。同時(shí)以編碼該突變體的質(zhì)粒免疫小鼠,顯示具有很好的免疫效力。本研究中,我們通過(guò)引入二硫鍵以進(jìn)一步增強(qiáng)M1-F蛋白的熱穩(wěn)定性。突變體M1-F-1及M1-F-5有較高的表達(dá)量,因此對(duì)他們的熱穩(wěn)定開展進(jìn)一步的研究。質(zhì)粒表達(dá)的兩種突變體蛋白,經(jīng)55℃孵育10分鐘,顯示融合前(?)表位的穩(wěn)定性明顯高于F和M1-F;M1-F-5在V表位也顯示出比F、M1-F和M1-F-1更強(qiáng)的穩(wěn)定性。在綜合分析表達(dá)量與穩(wěn)定性的情況下,37℃孵育2天后,M1-F-1的(?)表位含量明顯強(qiáng)于其它任何組別。另外,在4℃或-20℃孵育0至4天,M1-F-1均顯示出較多的(?)表位含量。同時(shí),與編碼F蛋白的質(zhì)粒相比,編碼M1-F-1突變體的質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生的血清抗體顯著較低,但其中和抗體滴度明顯增加,RSV攻毒后,M1-F-1組小鼠肺臟的病毒滴度與肺組織損傷明顯降低。綜上所述,嵌入式CpG佐劑是增強(qiáng)RSV疫苗免疫原性及誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1偏向的保護(hù)性免疫應(yīng)答的有效方法,同時(shí),突變F0前體上位于上游的弗林酶切割位點(diǎn)和引入二硫鍵可得到一種具有更多融合前表位和較高熱穩(wěn)定性的F蛋白,體內(nèi)研究顯示這種F蛋白突變體誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力明顯增強(qiáng)。這些工作為進(jìn)一步獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的RSV疫苗奠定了重要基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

擾素的產(chǎn)量或活性，并發(fā)揮佐劑作用誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答［３４，３９，邋４Ｍ３］。而逡逑ｒＢＣＧ－Ｎ－ｈＲＳＶ是卡介苗與ＲＳＶ疫苗的嵌合型疫苗，因此該疫苗可以同時(shí)抵御結(jié)核逡逑分枝桿菌及ＲＳＶ病毒的感染［４４＿Ｍ邋（圖１－３）。逡逑（３）載體疫苗逡逑載體疫苗是以病毒或細(xì)菌為載體，并將含有保護(hù)性抗原基因的載體導(dǎo)入宿主逡逑細(xì)胞中，在宿主細(xì)胞中表達(dá)保護(hù)性抗原并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的疫苗。目前，逡逑處于臨床階段的ＲＳＶ載體疫苗中，ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ是以痘苗病毒安卡拉株為載體［４７，逡逑４８］，而邋ＣｈＡｄｌ５５－ＲＳＶ，邋ＶＸＡ－ＲＳＶ－ｆ邋和邋Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ邋均以腺病毒為載體（圖邋１－３）逡逑［４９＿５２］。其中ＣｈＡｄｌ５５－ＲＳＶ以復(fù)制缺陷的１５５型黑猩猩腺病毒為載體，而ＶＸＡ－ＲＳＶｆ逡逑為Ａｄ５作為載體的口服疫苗，Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ是以Ａｄ２６為載體、以Ｐｒｅ－Ｆ為抗原逡逑的針對(duì)嬰幼兒及老年人的疫苗。ＤＮＡ疫苗也屬于載體疫苗，它是將含有抗原蛋白逡逑４逡逑

轉(zhuǎn)染的逡逑宿主細(xì)胞逡逑圖１－４在ＤＮＡ疫苗的設(shè)計(jì)、配制和接種中提高體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率和抗原免疫原性的關(guān)鍵因素（修逡逑改自文獻(xiàn)＿）逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｋｅｙ邋ｆａｃｔｏｒｓ邋ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｄｅｓｉｇｎ，邋ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，邋ａｎｄ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＤＮＡ邋ｖａｃｃｉｎｅｓ邋ｔｏ逡逑ｉｍｐｒｏｖｅ邋ｉｎ邋ｖｉｖｏ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ邋ａｎｄ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ邋（ｍｏｄｉｆｉｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ邋［８５］）逡逑答的佐劑，而且還具有Ａ類及Ｂ類ＣｐＧ的生物活性。雖然目前還沒有進(jìn)入臨床試逡逑驗(yàn)的報(bào)道，但己用于治療感染性疾病、過(guò)敏及癌癥的研究［７５，７９］。另外，ＣｐＧ－Ｃ序逡逑列還被插入到ＤＮＡ疫苗的載體中，以嵌入型佐劑的方式增強(qiáng)免疫應(yīng)答以抵御細(xì)菌逡逑９逡逑

我們同時(shí)可以引入一系列的突變，利用形成二硫鍵的方式穩(wěn)定融合前逡逑結(jié)構(gòu)，從而使抗原產(chǎn)生更高效的中和抗體，增強(qiáng)疫苗的保護(hù)性。逡逑該項(xiàng)研究的技術(shù)路線圖如圖１－７所示。通過(guò)上述研宄方案，研究ＣｐＧ－Ｃ佐劑逡逑對(duì)免疫應(yīng)答類型的影響及其對(duì)免疫原性的提高。解決ＤＮＡ疫苗引起的免疫反應(yīng)較逡逑弱的問(wèn)題。而對(duì)Ｆ蛋白的改造，能夠從抗原自身提高免疫保護(hù)作用，改造后的Ｆ逡逑蛋白不僅局限于ＤＮＡ疫苗，在腺病毒疫苗或亞單位疫苗都有很好的應(yīng)用前景。逡逑值得一提的是，光信號(hào)檢測(cè)技術(shù)在課題的研究過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，如ＤＮＡ逡逑的檢測(cè)與定量、蛋白質(zhì)及其表位的定性與定量、血清抗體及中和抗體水平和病毒逡逑攻擊后小鼠肺組織病毒感染狀況等，這些技術(shù)及其原理和應(yīng)用等見表１－３。其中，逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ、Ｄｏｔ邋ｂｌｏｔ、免疫熒光和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)有著相近的實(shí)驗(yàn)原理（圖１－８），逡逑１４逡逑

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本文編號(hào)：2795107