【摘要】：背景:交鏈孢霉是與過敏性疾病相關的最常見霉菌之一�？諝庵懈咚降慕绘滄呙贡┞读渴窍l(fā)作的重要危險因素,兒童早期對交鏈孢霉過敏也是哮喘的獨立危險因素。過敏原免疫治療仍然是治療過敏性疾病的唯一疾病對因療法。高質(zhì)量的過敏原疫苗是免疫治療取得療效的最重要的因素之一,然而目前臨床上應用的交鏈孢霉提取物大多來源于天然過敏原,其成分復雜,直接影響了免疫治療的療效和安全性。另外,由于不同的培養(yǎng)環(huán)境、品種差異、提純工藝、檢驗流程都存在巨大差異,使得過敏原提取物很難實現(xiàn)統(tǒng)一的標準化生產(chǎn)。目的:我們的目的是使用噬菌體展示肽模擬交鏈孢霉B細胞表位,合成模擬表位疫苗,并評價交鏈孢霉B細胞表位模擬肽疫苗對Balb/c小鼠哮喘模型氣道炎癥的治療作用。方法:1.運用噬菌體展示肽技術,首先使用健康人血清庫孵育噬菌體庫三次,篩去噬菌體庫中與交鏈孢霉特異性IgE非特異性結合的部分,然后再與交鏈孢霉過敏病人血清池孵育三次,篩選可以特異性結合交鏈孢霉特異性IgE高變區(qū)的B細胞模擬表位。2.將上述模擬表位經(jīng)過擴增孵育后進行DNA測序并與交鏈孢霉組分三維結構匹配,篩選出匹配性高的交鏈孢霉模擬表位合成模擬肽疫苗。得到的疫苗再與交鏈孢霉過敏患者血清中特異性IgE進行結合實驗和抑制實驗以及與交鏈孢霉患者嗜堿性粒細胞進行活化抑制實驗驗證其可靠性。3.建立小鼠哮喘模型,將六周齡Balb/c雌性小鼠隨機分為空白對照組、模型組、無關噬菌體對照治療組、交鏈孢霉提取物治療組和模擬肽疫苗治療組共5組,每組6只。小鼠在第4、5、6天用交鏈孢霉提取物滴鼻致敏,空白組給予0.9%生理鹽水。在第18、19、20天用交鏈孢霉提取物激發(fā),第36、37、38天再次激發(fā),空白組用0.9%生理鹽水。第21、22天,取血驗證模擬肽疫苗與哮喘小鼠血清IgE的結合力。在第23、24、25、26天,用0.9%生理鹽水、無關噬菌體對照、交鏈孢霉提取物和模擬肽疫苗對相應小鼠進行皮下注射。老鼠在最后一次激發(fā)后48小時內(nèi)處死。結果:1.相對于模型組和無關噬菌體對照組小鼠的癥狀如毛發(fā)雜亂,焦躁不安或過于安靜,抓鼻,流鼻涕,點頭呼吸,呼吸加快等,模擬肽疫苗治療組小鼠癥狀明顯改善。2.相比于模型組和無關噬菌體對照組小鼠,模擬肽疫苗治療組小鼠BALF炎性細胞組數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)降低。3.模擬肽疫苗治療組小鼠相對于模型組和無關噬菌體對照組小鼠,血清總IgE和特異性IgE降低,總IgG1和特異性IgG1升高。4.模擬肽疫苗治療組小鼠相對于模型組和無關噬菌體對照組小鼠,肺泡灌洗液中IFN-γ升高,IL-4降低。5.相對于模型組和無關噬菌體對照組小鼠,模擬肽疫苗治療組小鼠肺泡灌洗液中Th1/Th2細胞比例增加。6.模擬肽疫苗治療組肺泡與支氣管炎性細胞浸潤明顯減少、氣道狹窄好轉(zhuǎn)。結論:結果表明,交鏈孢霉B細胞模擬肽疫苗能改善小鼠哮喘模型的過敏性炎癥反應,并可能作為IgE介導的交鏈孢霉過敏性疾病潛在的新型治療藥物。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R-332;R562.25
【圖文】：

中 科 技 大 學 博 士 學 噬菌體展示肽技術篩選交鏈孢用噬菌體展示肽技術篩選并初步確定模擬肽示模擬肽篩選特異性多肽的生物技術。它是的外殼基因中而又不破壞基因編碼蛋白的能示在噬菌體的外殼蛋白中。當嵌入的 DNA 片會組成一個肽庫，這種多肽是以噬菌體為載可以被巨量的噬菌體中的特定噬菌體所識別的氨基酸序列得到這種多肽。[40-45]（圖 1）為核苷酸序列，外周為蛋白質(zhì)外殼。

14圖 2. 噬菌體肽庫淘選流程驗材料要材料菌體隨機七肽庫試劑盒（Phage Display Peptide Library，Ph.D.-7）購自 d Bioland Biolabs 公司；搜集自華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院過敏反應科門診 2015 年 1 12 月就診的交鏈孢霉過敏患者的血清，患者初次檢測皮膚點刺結果陽oCAP-250 檢測為交鏈孢霉特異性 IgE 陽性，最終選取 30 例未接受治療的

華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文紙巾上拍去殘留液體，一共洗板五次。2.3.6 將微孔板清洗干凈后加入 100μl 的 BSA（1 mg/ml）+甘氨酸-HCl (pH 2.2)來分離噬菌體：室溫搖床 15 分鐘左右，加入 Tris-HCl（pH 9.1）15μl 來中和洗脫液，這就是我們的目標噬菌體洗脫液。2.3.7 上述步驟重復三次。（圖 3）

本文編號：2792672