【摘要】：背景:交鏈孢霉是與過(guò)敏性疾病相關(guān)的最常見(jiàn)霉菌之一�？諝庵懈咚降慕绘滄呙贡┞读渴窍l(fā)作的重要危險(xiǎn)因素,兒童早期對(duì)交鏈孢霉過(guò)敏也是哮喘的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。過(guò)敏原免疫治療仍然是治療過(guò)敏性疾病的唯一疾病對(duì)因療法。高質(zhì)量的過(guò)敏原疫苗是免疫治療取得療效的最重要的因素之一,然而目前臨床上應(yīng)用的交鏈孢霉提取物大多來(lái)源于天然過(guò)敏原,其成分復(fù)雜,直接影響了免疫治療的療效和安全性。另外,由于不同的培養(yǎng)環(huán)境、品種差異、提純工藝、檢驗(yàn)流程都存在巨大差異,使得過(guò)敏原提取物很難實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。目的:我們的目的是使用噬菌體展示肽模擬交鏈孢霉B細(xì)胞表位,合成模擬表位疫苗,并評(píng)價(jià)交鏈孢霉B細(xì)胞表位模擬肽疫苗對(duì)Balb/c小鼠哮喘模型氣道炎癥的治療作用。方法:1.運(yùn)用噬菌體展示肽技術(shù),首先使用健康人血清庫(kù)孵育噬菌體庫(kù)三次,篩去噬菌體庫(kù)中與交鏈孢霉特異性IgE非特異性結(jié)合的部分,然后再與交鏈孢霉過(guò)敏病人血清池孵育三次,篩選可以特異性結(jié)合交鏈孢霉特異性IgE高變區(qū)的B細(xì)胞模擬表位。2.將上述模擬表位經(jīng)過(guò)擴(kuò)增孵育后進(jìn)行DNA測(cè)序并與交鏈孢霉組分三維結(jié)構(gòu)匹配,篩選出匹配性高的交鏈孢霉模擬表位合成模擬肽疫苗。得到的疫苗再與交鏈孢霉過(guò)敏患者血清中特異性IgE進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)和抑制實(shí)驗(yàn)以及與交鏈孢霉患者嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行活化抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其可靠性。3.建立小鼠哮喘模型,將六周齡Balb/c雌性小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、無(wú)關(guān)噬菌體對(duì)照治療組、交鏈孢霉提取物治療組和模擬肽疫苗治療組共5組,每組6只。小鼠在第4、5、6天用交鏈孢霉提取物滴鼻致敏,空白組給予0.9%生理鹽水。在第18、19、20天用交鏈孢霉提取物激發(fā),第36、37、38天再次激發(fā),空白組用0.9%生理鹽水。第21、22天,取血驗(yàn)證模擬肽疫苗與哮喘小鼠血清IgE的結(jié)合力。在第23、24、25、26天,用0.9%生理鹽水、無(wú)關(guān)噬菌體對(duì)照、交鏈孢霉提取物和模擬肽疫苗對(duì)相應(yīng)小鼠進(jìn)行皮下注射。老鼠在最后一次激發(fā)后48小時(shí)內(nèi)處死。結(jié)果:1.相對(duì)于模型組和無(wú)關(guān)噬菌體對(duì)照組小鼠的癥狀如毛發(fā)雜亂,焦躁不安或過(guò)于安靜,抓鼻,流鼻涕,點(diǎn)頭呼吸,呼吸加快等,模擬肽疫苗治療組小鼠癥狀明顯改善。2.相比于模型組和無(wú)關(guān)噬菌體對(duì)照組小鼠,模擬肽疫苗治療組小鼠BALF炎性細(xì)胞組數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)降低。3.模擬肽疫苗治療組小鼠相對(duì)于模型組和無(wú)關(guān)噬菌體對(duì)照組小鼠,血清總IgE和特異性IgE降低,總IgG1和特異性IgG1升高。4.模擬肽疫苗治療組小鼠相對(duì)于模型組和無(wú)關(guān)噬菌體對(duì)照組小鼠,肺泡灌洗液中IFN-γ升高,IL-4降低。5.相對(duì)于模型組和無(wú)關(guān)噬菌體對(duì)照組小鼠,模擬肽疫苗治療組小鼠肺泡灌洗液中Th1/Th2細(xì)胞比例增加。6.模擬肽疫苗治療組肺泡與支氣管炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少、氣道狹窄好轉(zhuǎn)。結(jié)論:結(jié)果表明,交鏈孢霉B細(xì)胞模擬肽疫苗能改善小鼠哮喘模型的過(guò)敏性炎癥反應(yīng),并可能作為IgE介導(dǎo)的交鏈孢霉過(guò)敏性疾病潛在的新型治療藥物。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R-332;R562.25
【圖文】：

中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 噬菌體展示肽技術(shù)篩選交鏈孢用噬菌體展示肽技術(shù)篩選并初步確定模擬肽示模擬肽篩選特異性多肽的生物技術(shù)。它是的外殼基因中而又不破壞基因編碼蛋白的能示在噬菌體的外殼蛋白中。當(dāng)嵌入的 DNA 片會(huì)組成一個(gè)肽庫(kù)，這種多肽是以噬菌體為載可以被巨量的噬菌體中的特定噬菌體所識(shí)別的氨基酸序列得到這種多肽。[40-45]（圖 1）為核苷酸序列，外周為蛋白質(zhì)外殼。

14圖 2. 噬菌體肽庫(kù)淘選流程驗(yàn)材料要材料菌體隨機(jī)七肽庫(kù)試劑盒（Phage Display Peptide Library，Ph.D.-7）購(gòu)自 d Bioland Biolabs 公司；搜集自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院過(guò)敏反應(yīng)科門診 2015 年 1 12 月就診的交鏈孢霉過(guò)敏患者的血清，患者初次檢測(cè)皮膚點(diǎn)刺結(jié)果陽(yáng)oCAP-250 檢測(cè)為交鏈孢霉特異性 IgE 陽(yáng)性，最終選取 30 例未接受治療的

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文紙巾上拍去殘留液體，一共洗板五次。2.3.6 將微孔板清洗干凈后加入 100μl 的 BSA（1 mg/ml）+甘氨酸-HCl (pH 2.2)來(lái)分離噬菌體：室溫?fù)u床 15 分鐘左右，加入 Tris-HCl（pH 9.1）15μl 來(lái)中和洗脫液，這就是我們的目標(biāo)噬菌體洗脫液。2.3.7 上述步驟重復(fù)三次。（圖 3）

本文編號(hào)：2792672