【摘要】：甲型和乙型流感病毒是威脅人類健康的主要病原體,其基因組結(jié)構(gòu)及編碼的蛋白都非常相似。甲型和乙型流感病毒分別能夠在型內(nèi)或譜系間發(fā)生重配,但不能發(fā)生型間重配。甲型和乙型流感病毒的啟動子序列高度保守,但它們在核苷酸構(gòu)成上存在明顯差異,這些差異元素的生物學(xué)意義尚不清楚。因此,本研究擬從甲型和乙型流感病毒啟動子的差異元素入手,探索它們在型間病毒復(fù)制中的生物學(xué)意義。本研究中,我們分別對甲型和乙型流感病毒各基因片段的啟動子序列進行了大規(guī)模的生物信息學(xué)分析,全面展示了甲型和乙型流感病毒啟動子區(qū)的序列特征,發(fā)現(xiàn)了型特異性啟動子元素的存在,分別為甲型流感病毒vRNA啟動子中的5U、6'A和乙型流感病毒vRNA啟動子中的5C、6'U。我們建立了甲型(A/WSN)和乙型(B/Yam)流感病毒的小型復(fù)制子系統(tǒng),并比較了甲型和乙型流感病毒聚合酶對同型和異型vRNA模板的偏好性,結(jié)果表明,在小型復(fù)制子系統(tǒng)中,甲型和乙型流感病毒聚合酶都更偏好同型模板。隨后,我們利用該系統(tǒng),深入地研究了型特異性啟動子元素互換對甲型和乙型流感病毒RNA合成和蛋白表達的影響,通過這些實驗,我們首次發(fā)現(xiàn)型特異性啟動子元素——vRNA啟動子3'端第5個核苷酸是關(guān)鍵的啟動子元素,它能夠特異性地識別甲型和乙型流感病毒聚合酶。另外,我們通過體內(nèi)、體外聚合酶活性試驗,深入地探索了甲型和乙型流感病毒vRNA啟動子3'端第5個核苷酸的特性在調(diào)節(jié)體內(nèi)、體外聚合酶活性中的作用,結(jié)果表明,甲型和乙型流感病毒型特異性的啟動子元素——vRNA啟動子3'端第5個核苷酸的特性直接決定了聚合酶活性,它能夠在RNA合成的起始和延伸的多個環(huán)節(jié)起作用。隨后,我們利用反向遺傳學(xué)技術(shù),研究了這些啟動子元素突變對病毒復(fù)制的影響。我們在病毒感染水平上確認了甲型和乙型流感病毒vRNA啟動子3'端第5個核苷酸是調(diào)節(jié)型特異性的關(guān)鍵位點。有趣的是,甲型和乙型流感病毒對型特異性啟動子元素互換突變的表現(xiàn)不同,其中在甲型流感病毒A/WSN中,將甲型特異性U5替代為乙型特異性C5,傳代2-3次后,該位點能迅速地發(fā)生回復(fù)突變,而在乙型流感病毒B/Yam中,將乙型特異性C5替代為甲型特異性U5,經(jīng)連續(xù)傳代后,仍然能夠保留該突變,但明顯降低了病毒的復(fù)制效率。這些結(jié)果強調(diào)了甲型和乙型流感病毒對核苷酸突變的容忍度及其聚合酶的糾錯能力存在明顯差異。總之,本研究首次發(fā)現(xiàn)并揭示了甲型和乙型流感病毒型特異性啟動子元素3'端第5個核苷酸是決定型特異性的關(guān)鍵位點。這表明甲型和乙型流感病毒啟動子的變化會引起核糖核蛋白復(fù)合物的不匹配,對進一步闡明甲型和乙型流感病毒不能發(fā)生型間重配的機制具有重要的指導(dǎo)意義,也豐富了我們對流感病毒型特異性以及啟動子生物學(xué)意義的認識。本課題還揭示了甲型和乙型流感病毒聚合酶在轉(zhuǎn)錄機制上存在的細微差異,這些功能差異將為甲型和乙型流感病毒聚合酶結(jié)構(gòu)的研究提供重要素材。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R373.13
【圖文】：

逑？邋ＨＡ邋0ＮＡ邋｜｜邋Ｍ２邋0邋ＮＥｆ＞邋？Ｍ１邐零邋ＨＡ邋ｆＮＡ邋ｆＢＭ２邋：邋ＮＢ邋０邋ＮＥ（＞邋？Ｍ１逡逑圖１－１甲型流感病毒（Ａ圖）和乙型流感病毒（Ｂ圖）結(jié)構(gòu)示意圖１１５１逡逑１．１．２流感病毒的生命周期逡逑流感病毒的生命周期主要包含下列幾個方面：吸附和進入到宿主細胞，ｖＲＮＰ逡逑進入宿主細胞核，流感病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，ｖＲＮＰ出核和病毒的組裝和釋放逡逑（圖邋１－２）。逡逑＃ＩＦＮ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邐ｆ邋＇逡逑；邋ａｎｔｉｖｉｒａｌ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ逡逑丁邋》ｙ邐Ｆｔｅｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｏＪ逡逑／邐ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ逡逑＊．邐Ｉ邐Ｐａｃｋｉｎｇ逡逑ｙ邐Ｉ逡逑ＥｎｄｏｃｙｔｏｓｌｓＪ邐Ｃｆ＊Ｓｌ＞邋邋邐ＴｒａｎｓＵｔｉｏｎ邋■逡逑，邋一邋＼邐ｔ逡逑Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ逡逑ｍＲＮＡ邋＼逡逑（＋）ｃＲＮＡ？＝＝＝ａ逡逑＼邐Ｆｕｓｉｏｎ邋ａｎｄ邐Ｎｕｃｌｅｕｓ邋，逡逑、＇邐ｕｎｃｏａｔｉｎｇ逡逑圖１－２甲型流感病毒的生命周期示意圖１１６１逡逑１．吸附到宿主細胞逡逑流感病毒從ＨＡ與宿主細胞膜上的唾液酸受體的結(jié)合開始其生命周期ｍ0ＨＡ為逡逑Ｉ型糖蛋白，以同源三聚體（ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒ）形式存在，它被包埋于病毒脂質(zhì)囊膜表面逡逑的纖突［１］。ＨＡ０是ＨＡ的前體，ＨＡ１和ＨＡ２兩個亞基系ＨＡ０裂解生成，受體結(jié)合逡逑結(jié)構(gòu)域位于ＨＡ１上，是一種跨膜結(jié)構(gòu)域，它可以插入到病毒囊膜的表面，融合肽逡逑位于ＨＡ２上

ｖＲＮＡ、ｃＲＮＡ和ｍＲＮＡ水平，研宄證實了真實的ｃＲＮＡ啟動子也采取ｃｏｒｋｓｃｒｅｗ逡逑結(jié)構(gòu)模型，而且發(fā)現(xiàn)３＇端的四核苷酸環(huán)上的第４、５、７堿基和２－９堿基對（ｂａｓｅ邋ｐａｉｒ）逡逑對于ｃＲＮＡ啟動子活性非常重要（圖１－４）。另外，通過體外聚合酶結(jié)合實驗（／／？邋ｖ／ｒｒｏ逡逑ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ａｓｓａｙ）進一步確定了邋ｃＲＮＡ啟動子５＇端發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，但仍逡逑無直接證據(jù)表明３’端發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，其具體功能尚不知曉。逡逑１４逡逑

動子ｃｏｒｋｓｃｒｅｗ結(jié)構(gòu)模型［６｜］。該模型的主要特征為３＇和５＇端的保守序列能夠形成兩逡逑個短發(fā)卡環(huán)（ｈａｉｒｐｉｎ邋ｌｏｏｐ）結(jié)構(gòu)，每個發(fā)卡環(huán)都含有一個２個核苷酸長度的蓮部和逡逑一個四核苷酸環(huán)（ｔｅｔｒａｌｏｏｐ），它們通過堿基配對的ｄｕｐｌｅｘ區(qū)域（圖１－４方框標注處）逡逑連接起來（圖１－４）。體外實驗表明５＇端的發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)為體外轉(zhuǎn)錄（ＡｐＧ－ｐｒｉｍｅｄ逡逑ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）邋｜５ｔ）］和ｍＲＮＡ的多聚腺苷酸化１６２１所必需，而３＇和５＇端的發(fā)卡環(huán)同時存逡逑在不僅是維持內(nèi)切酶活性所必需的［５６，５８］，而且對于維持聚合酶的穩(wěn)定性也有一定作逡逑用［５９］。另外，有研究認為當(dāng)加帽的ＲＮＡ底物含有ＣＡ裂解位點（ＣＡｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅ），逡逑即能夠產(chǎn)生含有以ＣＡ為末端含有帽子結(jié)構(gòu)的引物時，ｖＲＮＡ的３＇端只作為ｍＲＮＡ逡逑合成的模板，無須發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)［６３］。逡逑１．１．５核糖核蛋白復(fù)合物（ＲＮＰ）的功能逡逑流感病毒生命周期中作用極其重要的成分是核糖核蛋白復(fù)合物（ＲＮＰ）邋１６４１邋（圖逡逑１－５）。ＲＮＰ使流感病毒的基因組衣殼化，它是流感病毒基因組進行轉(zhuǎn)錄逡逑（ｖＲＮＡ—ｍＲＮＡ）和復(fù)制（ｖＲＮＡ＾ｃＲＮＡ）的最小功能單元。病毒吸附至ＩＪ宿主細逡逑胞，發(fā)生低ＰＨ誘導(dǎo)的內(nèi)吞之后，病毒中的ＲＮＰ釋放到宿主細胞胞漿中。在宿主細逡逑胞轉(zhuǎn)運機制的作用下

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本文編號：2791895