本文關(guān)鍵詞：乙型腦炎病毒的分離鑒定及其在microRNA水平上與PK-15細(xì)胞的相互作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：流行性乙型腦炎病毒(JEV)是一種危害嚴(yán)重的人畜共患病病原,屬于黃病毒科黃病毒屬。該病毒嚴(yán)重威脅人類健康,感染人后入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng),造成死亡或者留下嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。同時它可以感染豬群,造成種豬繁殖障礙,嚴(yán)重制約養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,也造成巨大的經(jīng)濟損失。microRNA (miRNA)作為一種在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因調(diào)控功能的非編碼小分子RNA,在細(xì)胞生長、分化、凋亡和代謝等生命過程中發(fā)揮著不可替代的作用,并且在病毒感染入侵及宿主細(xì)胞的抗病毒方面起著重要的調(diào)節(jié)作用。而目前對于JEV在miRNA水平上與PK-15細(xì)胞相互作用的研究暫無報道,相關(guān)研究對于深入了解JEV的致病機制及JEV的防控十分重要。本研究具體內(nèi)容如下：通過觀察細(xì)胞病變(CPE)情況及PCR檢測,利用BHK-21細(xì)胞從四川流產(chǎn)死豬胎樣品中成功分離出3株JEV,分別命名為JEV-SC-1株、JEV-SC-2株與JEV-SC-3株,基因分型研究顯示3株病毒株均為基因Ⅲ型,其TCID50分別為10-5.81/0.025ml、10-5.12/0.025ml及10-4·42/0.025m1。選取JEV-SC-1株為代表株分別感染BHK-21、Vero和PK-15細(xì)胞后,觀察CPE及利用本研究建立的熒光定量PCR方法分別繪制其在這三種細(xì)胞中的一步生長曲線。結(jié)果顯示,JEV在這三種細(xì)胞中均能增殖且能產(chǎn)生不同程度的CPE:JEV感染BHK-21細(xì)胞后36h開始出現(xiàn)CPE,而感染Vero、PK-15細(xì)胞后48h開始出現(xiàn)CPE; JEV感染BHK-21細(xì)胞后0h-24h增長緩慢,24h-48h呈對數(shù)增長,48h-72h增長速度減緩,60h達到最大值,隨后病毒含量逐步下降；感染Vero細(xì)胞后0h-12h增長緩慢,12h-48h呈對數(shù)增長,48h-72h增長速度減緩,維持在較高的水平,72h后病毒含量快速下降；感染PK-15細(xì)胞后0h-24h增長緩慢,24h-60h呈對數(shù)增長,60h-84h增長速度減緩,隨后病毒含量逐步下降。同時比較這三條一步生長曲線發(fā)現(xiàn)JEV感染Vero細(xì)胞后的病毒滴度均較Vero、PK-15細(xì)胞高。結(jié)果表明JEV感染BHK-21細(xì)胞后出現(xiàn)CPE的時間較Vero、PK-15細(xì)胞早,感染Vero細(xì)胞后較BHK-21、PK-15細(xì)胞更快進入對數(shù)期且病毒滴度也更高。本試驗為大規(guī)模生產(chǎn)疫苗提供理論支持,同時也為進一步研究JEV-SC-1株的生物特性奠定基礎(chǔ)。利用高通量測序分析技術(shù),鑒定感染與非感染JEV狀態(tài)下PK-15細(xì)胞的miRNA并進行差異表達分析。結(jié)果顯示,本研究共鑒定出 565個niRNA,其中在JEV感染PK-15細(xì)胞中共鑒定出522個1miRNA,在JEV未感染PK-15細(xì)胞中共鑒定出427個miRNA.同時獲得了132個差異表達的miRNA,其中78個miRNA顯著上調(diào),54個miRNA顯著下調(diào)。并通過熒光定量PCR方法對所選取的差異表達miRNA進行了驗證。整合TargetScan和miRanda兩個數(shù)據(jù)庫的算法分別對上調(diào)與下調(diào)miRNA進行靶基因的預(yù)測。隨后對這些差異表達miRNA的靶基因進行Gene Ontology (GO)分析,結(jié)果顯示,這些差異表達的miRNA功能富集在許多復(fù)雜的細(xì)胞通路上,包括metabolic process, inflammatory response及immune response。該結(jié)果為進一步揭示miRNA在JEV感染過程中的作用及篩選抗JEV候選miRNA奠定了基礎(chǔ)。本試驗通過軟件預(yù)測靶向病毒基因組的miRNA,并根據(jù)JEV感染PK-15細(xì)胞前后miRNA差異表達情況,選擇了表達上調(diào)的mir-145-5p,表達下調(diào)的mir-744,差異表達譜中上調(diào)、下調(diào)水平最顯著的mir-450a、mir-18a,與病毒基因組結(jié)合能力最強的mir-499-5p及目前研究報道具有潛在抗病毒能力的mir-10、mir-181a進行試驗,以期篩選到能夠抑制JEV復(fù)制的miRNA.將上述7個miRNA mimics及陰性對照mir-NC轉(zhuǎn)入PK-15細(xì)胞6h后感染JEV (MOI為0.05),并以只接毒細(xì)胞組(NT)作對照,分別在病毒感染后12h、36h收取上清,然后統(tǒng)一提取總RNA進行qPCR檢測。結(jié)果顯示JEV感染細(xì)胞12h、36h后mir-NC組與NT組病毒含量差異均不大,表明：miRNA mimics及轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞無毒性作用,其中mir-145-5p、mir-499-5p、mir-18a及mir-450a均能不同程度抑制JEV的基因表達水平,而mir-499-5p抑制JEV能力最強。本試驗結(jié)果為一步驗證mir-499-5p抑制JEV復(fù)制的效果奠定基礎(chǔ),同時也為宿主miRNA作為抗病毒基因藥物提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：流行性乙型腦炎病毒 分離鑒定 microRNA PK-15細(xì)胞 病毒復(fù)制
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373.31
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 主要縮略詞9-12
• 第一部分 文獻綜述12-26
• 1 流行性乙型腦炎研究現(xiàn)狀12-18
• 1.1 病原學(xué)12-14
• 1.1.1 病毒結(jié)構(gòu)及功能12-13
• 1.1.2 病毒分型13
• 1.1.3 病毒培養(yǎng)特性及理化性質(zhì)13-14
• 1.2 流行病學(xué)14-15
• 1.2.1 傳播媒介14
• 1.2.2 流行動態(tài)及嚴(yán)重性14-15
• 1.3 病毒復(fù)制15-16
• 1.4 致病機理16-17
• 1.5 控制措施17-18
• 2 microRNA研究進展18-24
• 2.1 miRNA的產(chǎn)生18-19
• 2.2 miRNA的作用機制19-20
• 2.3 miRNA與病毒20-23
• 2.3.1 病毒編碼的miRNA調(diào)控病毒和宿主基因表達20-22
• 2.3.2 宿主miRNA在病毒感染過程中的調(diào)節(jié)作用22-23
• 2.4 miRNA的鑒定方法23-24
• 3 目的與意義24-26
• 第二部分 實驗部分26-62
• 第一章 乙型腦炎病毒的分離鑒定及增殖特性研究26-40
• 1 實驗材料26-28
• 1.1 主要試劑26-27
• 1.2 主要培養(yǎng)基及其配制27
• 1.3 主要儀器27-28
• 2 實驗方法28-31
• 2.1 引物設(shè)計與合成28
• 2.2 樣品采集28
• 2.3 病料檢測28
• 2.4 病料處理28-29
• 2.5 病毒分離29
• 2.6 病毒蝕斑純化29
• 2.7 病毒株的鑒定29-30
• 2.8 病毒TCID_(50)的測定30
• 2.9 熒光定量PCR方法的建立30-31
• 2.10 JEV分別在BHK-21、Vero和PK-15細(xì)胞上的增殖規(guī)律31
• 3 實驗結(jié)果31-37
• 3.1 病料檢測結(jié)果31-32
• 3.2 病毒分離32
• 3.3 RT-PCR鑒定32-33
• 3.4 系統(tǒng)進化分析33-34
• 3.5 外源病毒檢測34
• 3.6 病毒TCID_(50)的測定34-35
• 3.7 熒光定量PCR方法的建立35-37
• 4 討論37-40
• 第二章 乙型腦病炎毒在microRNA水平上與PK-15細(xì)胞的相互作用研究40-62
• 1 實驗材料40-41
• 1.1 毒株與細(xì)胞40
• 1.2 主要試劑40-41
• 1.3 主要儀器41
• 2 實驗方法41-47
• 2.1 病毒感染41
• 2.2 細(xì)胞總RNA提取41
• 2.3 總RNA質(zhì)量鑒定41-42
• 2.4 Illumina Solexa高通量測序42
• 2.5 測序結(jié)果生物信息學(xué)分析42-43
• 2.6 差異miRNA表達譜的構(gòu)建43-44
• 2.7 熒光定量PCR分析44-46
• 2.8 差異表達miRNA靶基因預(yù)測和功能富集46
• 2.9 miRNA對JEV體外復(fù)制的影響46-47
• 3 實驗結(jié)果47-56
• 3.1 總RNA提取及檢測47
• 3.2 測序結(jié)果生物信息學(xué)分析47-50
• 3.3 差異表達的miRNA50-51
• 3.4 熒光定量PCR驗證51-52
• 3.5 表達差異miRNA靶基因的預(yù)測與GO分析52-54
• 3.6 miRNA對JEV體外復(fù)制的影響54-56
• 4 討論56-62
• 4.1 JEV感染PK-15細(xì)胞前后miRNA差異表達分析56-59
• 4.2 miRNA對JEV的抑制作用59-62
• 全文結(jié)論62-63
• 參考文獻63-74
• 致謝74-75
• 附錄75-101
• 附表1 在JEV感染與未感染PK-15細(xì)胞中miRNA的鑒定分析75-99
• 附表2 JEV感染PK-15細(xì)胞后差異表達的miRNA99-101
• 學(xué)術(shù)論文101-102

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