本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌CagA與YWHAE相互作用對(duì)細(xì)胞遷移的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(Cag A)是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)的重要毒力因子,與胃腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。本研究在已證實(shí)Cag A與胃黏膜上皮細(xì)胞YWHAE蛋白具有相互作用的前提下,應(yīng)用cag A野生株與缺失突變株的對(duì)比實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證Cag A對(duì)細(xì)胞功能的影響,進(jìn)而在此基礎(chǔ)上探討Cag A與YWHAE相互作用對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞遷移的影響,旨在進(jìn)一步闡明Hp Cag A的致病機(jī)制。方法:1.Cag A及YWHAE在細(xì)胞定位上的驗(yàn)證:通過Hp NCTC 11637標(biāo)準(zhǔn)株感染AGS細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞后,分別采用Cag A及YWHAE的特異性抗體處理細(xì)胞,用激光共聚焦顯微鏡觀察Cag A和YWHAE在細(xì)胞中的定位。2.構(gòu)建NCTC 11637 cag A基因缺失株NCTC 11637Δcag A:采用基因敲除同源重組原理,構(gòu)建帶卡那霉素抗性標(biāo)志的cag A缺失突變質(zhì)粒,電擊轉(zhuǎn)化到NCTC 11637標(biāo)準(zhǔn)株中,用卡那霉素篩選出NCTC 11637Δcag A,用PCR和Western blot技術(shù)鑒定cag A基因的缺失及Cag A蛋白的表達(dá)情況,將NCTC 11637△cag A連續(xù)傳25代進(jìn)行cag A基因缺失遺傳穩(wěn)定性的鑒定。3.NCTC 11637 Cag A對(duì)SGC7901細(xì)胞生物學(xué)功能的影響:將NCTC 11637和NCTC 11637Δcag A以MOI(Bacterium/Cell)=100分別感染SGC7901細(xì)胞,進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):Hp感染細(xì)胞5天,每天用MTS法檢測(cè)細(xì)胞的增殖,細(xì)胞增殖率=OD2-5d/OD1d;Hp感染細(xì)胞48h,用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期;劃痕劃線法檢測(cè)細(xì)胞遷移情況:Hp感染細(xì)胞6h后,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕劃線處理,用Carl Zeiss License Activation Tool對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照測(cè)量劃痕寬距,48h后觀察細(xì)胞遷移情況,細(xì)胞遷移距離=6h劃痕寬距-48h劃痕寬距。4.構(gòu)建YWHAE過表達(dá)及沉默的AGS細(xì)胞及SGC7901細(xì)胞:將本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的YWHAE真核表達(dá)質(zhì)粒p CMVTNT-YWHAE及YWHAE si RNA分別通過轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000及X-treme GENE si RNA transfection reagent轉(zhuǎn)染AGS及SGC7901細(xì)胞,48h后分別進(jìn)行Western blot驗(yàn)證YWHAE蛋白的表達(dá)情況及YWHAE si RNA的干擾效果。5.Cag A和YWHAE的相互作用對(duì)細(xì)胞遷移功能的影響:將本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的Cag A真核表達(dá)質(zhì)粒p CMVTNT-cag A,通過轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染AGS及SGC7901細(xì)胞,48h后進(jìn)行Western blot的驗(yàn)證;用不同濃度的p CMVTNT-cag A及p CMVTNT-YWHAE分別轉(zhuǎn)染AGS及SGC7901細(xì)胞,采用劃痕劃線法檢測(cè)細(xì)胞的遷移情況;選擇適當(dāng)濃度的p CMVTNT-cag A及p CMVTNT-YWHAE(或YWHAE si RNA)共轉(zhuǎn)染AGS和SGC7901細(xì)胞,同法檢測(cè)細(xì)胞遷移情況。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS20.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、析因設(shè)計(jì)方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果:1.通過細(xì)胞免疫熒光共定位,可以在AGS細(xì)胞及SGC7901細(xì)胞的胞漿中觀察到Cag A與YWHAE同時(shí)存在,表明了Cag A與YWHAE能共定位于AGS細(xì)胞及SGC7901細(xì)胞漿中。2.經(jīng)PCR、Western blot鑒定成功構(gòu)建了NCTC 11637 cag A基因缺失株,并經(jīng)連續(xù)傳25代,證明獲得了可穩(wěn)定遺傳的NCTC 11637Δcag A。3.NCTC 11637 Cag A對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能影響的驗(yàn)證(1)細(xì)胞增殖方面:細(xì)胞培養(yǎng)至第3-5天,NCTC 11637組細(xì)胞增殖速率大于NCTC11637Δcag A組,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,第3天及第5天有顯著性差異(P0.05);(2)細(xì)胞凋亡方面:細(xì)胞凋亡率NCTC 11637組(1.82%)較NCTC11637Δcag A組(2.55%)低(P0.01);(3)細(xì)胞周期方面:NCTC11637組G1期、S期、G2期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為60.77%、25.4%、13.04%,NCTC11637Δcag A組G1期、S期、G2期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分別為56.78%、28.27%、13.95%,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間在各期內(nèi)比較有顯著性差異(P0.05);(4)細(xì)胞遷移方面:NCTC 11637組細(xì)胞遷移距離(147.39μm)較NCTC11637Δcag A組細(xì)胞遷移距離(81.65μm)大(P0.05)。4.構(gòu)建YWHAE過表達(dá)及沉默的AGS及SGC7901細(xì)胞通過Western bolt驗(yàn)證,AGS及SGC790細(xì)胞中YWHAE蛋白的表達(dá)量:p CMVTNT-YWHAE組高于陰性對(duì)照p CMV-TNT組,YWHAE si RNA組低于陰性對(duì)照無關(guān)si RNA組(NC組)。5.Cag A與YWHAE的相互作用對(duì)細(xì)胞遷移的影響(1)通過Western bolt驗(yàn)證,在AGS及SGC790細(xì)胞中Cag A蛋白的表達(dá)量:p CMVTNT-cag A組高于陰性對(duì)照p CMV-TNT組。(2)在AGS及SGC7901細(xì)胞中均可觀察到:a.隨著p CMVTNT-cag A濃度的增高,細(xì)胞遷移距離逐漸增加;而隨著p CMVTNT-YWHAE濃度的增高,細(xì)胞遷移距離逐漸減少;b.共轉(zhuǎn)p CMVTNT-cag A、p CMVTNT-YWHAE后:細(xì)胞遷移距離CMV-YWAHECMVTNTCag A+YWHAECMV-Cag A,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,有顯著性差異(P0.05);c.共轉(zhuǎn)p CMVTNT-cag A、YWHAE si RNA后:細(xì)胞遷移距離CMV-YWAHE+NCCMVTNT+YWHAE si RNACag A+NCCag A+YWHAE si RNA,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:1.空間定位證明Cag A和YWHAE可在細(xì)胞內(nèi)相互作用。2.NCTC 11637 Cag A能夠促進(jìn)胃上皮細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、將細(xì)胞周期阻滯于G1期,并促進(jìn)細(xì)胞遷移。3.細(xì)胞YWHAE蛋白能夠減弱Cag A促細(xì)胞遷移的作用。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 CagA YWHAE 相互作用 細(xì)胞遷移
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 附錄一 英文縮略語4-7
• 附錄二 試劑配方7-10
• 附錄三 主要儀器設(shè)備10-11
• 中文摘要11-14
• 英文摘要14-18
• 前言18-20
• 材料和方法20-47
• 結(jié)果47-63
• 討論63-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 綜述70-85
• 參考文獻(xiàn)77-85
• 致謝85

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 鞠莉;多壁碳納米管對(duì)A549細(xì)胞毒作用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析[D];浙江大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 曾琴;14-3-3蛋白亞型在人胃癌組織中的表達(dá)及意義[D];南昌大學(xué);2012年

2 于紅靜;趨化因子CCL18、CXCL1促進(jìn)卵巢癌增殖和轉(zhuǎn)移分子機(jī)制初探[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

3 林文杰;雷公藤甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡與14-3-3γ蛋白的相關(guān)性研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2014年

4 同格樂;14-3-3ε、Annexin A1在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義[D];中南大學(xué);2014年

5 黃英;結(jié)腸癌多階段定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];中南大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌CagA與YWHAE相互作用對(duì)細(xì)胞遷移的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：278887