發(fā)布時間：2020-08-09 15:58

【摘要】：血細(xì)胞和血管的分化與發(fā)育是一個十分復(fù)雜的過程,其發(fā)育過程受一系列因子的精細(xì)調(diào)控。這些調(diào)控因子的突變或表達(dá)異常是血液和血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的內(nèi)在分子病因。目前對血細(xì)胞和血管分化與發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制仍有待深入研究。因此,本論文的目的是研究本實(shí)驗(yàn)室早期篩選的候選基因HDCG1在血細(xì)胞和血管分化與發(fā)育中的作用。本實(shí)驗(yàn)室對HDCG1基因的表達(dá)研究表明,該基因在血液中高表達(dá),提示HDCG1可能與血細(xì)胞的發(fā)育有關(guān),但對其在血細(xì)胞分化與發(fā)育中的作用未知。為了研究該基因調(diào)控血細(xì)胞發(fā)育的生物學(xué)作用,我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)建立了斑馬魚HDCG1基因的敲除模型,并通過Western blot等實(shí)驗(yàn)證明HDCG1基因的敲除模型是有效的。我們進(jìn)一步通過斑馬魚胚胎整體原位雜交實(shí)驗(yàn)、OD染色、蘇丹黑染色以及RT-QPCR等實(shí)驗(yàn)證明,在HDCG1敲除純合體中:1)原始造血和定向造血過程中的紅系細(xì)胞標(biāo)記gata1的表達(dá)水平與血紅蛋白基因hbbe1的表達(dá)水平顯著上調(diào);2)原始造血過程中,髓系標(biāo)記pu.1和mpo的表達(dá)水平幾乎不變,但L-plastin的表達(dá)水平顯著下調(diào),造血干細(xì)胞偏髓系細(xì)胞標(biāo)記cmyb和scl的表達(dá)水平下調(diào),而造血干細(xì)胞標(biāo)記runx1的表達(dá)水平幾乎不變;3)定向造血過程中,髓系標(biāo)記mpo和L-plastin的表達(dá)水平輕微下調(diào),淋巴系細(xì)胞的標(biāo)記rag1的表達(dá)水平顯著上調(diào),造血干細(xì)胞標(biāo)記cmyb、scl和runxl的表達(dá)水平下調(diào);4)O-Dianisidine染色結(jié)果表明血紅蛋白增多,蘇丹黑染色結(jié)果表明髓系粒細(xì)胞數(shù)目減少;5)血管內(nèi)皮標(biāo)記kdrl和fli1a與體節(jié)的標(biāo)記myod1的表達(dá)水平上調(diào);6)前腎組織標(biāo)記因子cd說17和脊索標(biāo)記因子shha的表達(dá)水平幾乎不變,提示HDCG1可能與前腎和脊索的發(fā)育無關(guān)。上述結(jié)果表明HDCG1在斑馬魚的原始造血和定向造血以及血管的發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。為排除胚胎原位雜交等技術(shù)研究可能出現(xiàn)的誤差,我們利用一系列的血液與血管熒光標(biāo)記品 系 TG(gata1:dsred),TG(pu.1:EGFP),TG(mpo:EGFP),TG(corola:EGFP),TG(runxl:EGFP),TG(scl:EGFP),TG(cmyb:EGFP),T:G(CD41:EGFP),T:G(fli1 a:EGFP)和 TG(kdrl:mcheriy)分別與HDCG1敲除純合體雜交,分析敲除HDCG1對血液與血管標(biāo)記的熒光信號變化影響,研究結(jié)果進(jìn)一步支持利用胚胎原位雜交等技術(shù)獲得結(jié)果的正確性。為了證明上述研究結(jié)果確實(shí)是由敲除HDCG1基因?qū)е碌耐蛔儽硇?我們合成HDCG1基因mRNA注射到HDCG1突變純合子胚胎的一細(xì)胞期細(xì)胞中,研究其是否能拯救HDCG1突變純合子導(dǎo)致的突變表型。研究結(jié)果證明過表達(dá)HDCG1確實(shí)能使敲除HDCG1導(dǎo)致的突變表型獲得拯救�？傊�,上述實(shí)驗(yàn)證明,HDCG1是一個調(diào)控斑馬魚的原始造血和定向造血以及血管發(fā)育的關(guān)鍵基因。HDCG1調(diào)控斑馬魚的原始造血和定向造血以及血管的發(fā)育過程的調(diào)控機(jī)制是什么呢?前人的研究報道wnt16通過與dld/dlc相互作用調(diào)控Notch信號途徑從而調(diào)控造血干細(xì)胞的發(fā)育,HDCG1基因是不是也和Notch信號途徑有關(guān)呢?我們用原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測了 Notch信號途徑相關(guān)的分子的表達(dá)情況,結(jié)果顯示在HDCG1純合突變體中,wnt19,dld和dlc的表達(dá)水平上調(diào),提示HDCG1基因可能通過Notch信號途徑調(diào)控造血干細(xì)胞的分化與發(fā)育。為了深入研究HDCG1基因是否還通過其他信號通路調(diào)控造血干細(xì)胞的分化與發(fā)育,我們利用敲除HDCG1基因純合突變體研究全轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)情況,選取24hpf時期的純合突變體胚胎送去公司做轉(zhuǎn)錄組測序,HDCG1純合突變體胚胎和WT胚胎組各做三個重復(fù)。測序結(jié)果分析表明,Notch信號途徑的相關(guān)因子的表達(dá)受到不同程度的影響,其結(jié)果與胚胎原位雜交獲得的結(jié)果相同。此外,測序結(jié)果還表明:Wnt信號途徑、Jak-Stat信號途徑、Fgf信號途徑、Tgfβ信號途徑以及血液血管血紅蛋白相關(guān)因子的表達(dá)也受到不同程度的影響。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果,我們選擇部分基因做了 QRT-PCR分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與全轉(zhuǎn)錄組測序得到了一致的結(jié)果,這說明HDCG1能影響多條信號通路以及和血液血管發(fā)育相關(guān)的基因的表達(dá)。為了鑒定HDCG1調(diào)控的直接靶基因,我們選擇野生型胚胎做了ChIP實(shí)驗(yàn),并將最后純化回收的總?cè)旧|(zhì)送去公司進(jìn)行全基因組的ChIP-Seq分析。分析結(jié)果表明,HDCG1可以結(jié)合在75個基因的promoter 上,其中 14 個基因egfl6、igsf8、slc25af8、ism1、kmt2a、st6galnac2、phkg1a、smfn、chst1、stat5b、cenpk、aggf1、uvrag 和 fam210b與血液血管的發(fā)育相關(guān)。為了驗(yàn)證ChIP-Seq的結(jié)果,我們做了ChIP-PCR分析,ChIP-QPCR實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果與ChIP-Seq結(jié)果一致。我們進(jìn)一步比較轉(zhuǎn)錄組測序與ChIP-Seq結(jié)果,篩選到其表達(dá)有顯著改變的基因與ChIP-Seq結(jié)果相吻合的5個候選靶基因:egf16、igsf8、stat5b、aggf1和ism1,我們對這五個候選靶基因用RT-PCR和QRT-PCR進(jìn)行表達(dá)分析,結(jié)果表明aggf1和igsf8基因在HDCG1純合突變體中的表達(dá)水平顯著上調(diào),ism1、stat5b和egf16基因在HDCG1純合突變體中的表達(dá)水平顯著下調(diào),與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致。Agf1被認(rèn)為是最早調(diào)控造血干細(xì)胞分化發(fā)育的因子,在中胚層分化成成血管細(xì)胞(將來發(fā)育成造血干細(xì)胞和血管細(xì)胞)這一過程發(fā)揮作用,提示aggf1可能是HDCG1的直接靶基因,HDCG1可能是一個比aggf1還位于更早期階段的調(diào)控造血干細(xì)胞分化發(fā)育的因子;大量研究表明,stat5b是調(diào)控造血發(fā)生的主控基因,且其與許多惡性血液疾病的發(fā)生有關(guān),我們的ChIP分析結(jié)果表明,stat5b可能是HDCG1的直接靶基因。因此,本課題接著將著重研究HDCG1如何通過aggf1和stat5b調(diào)控血細(xì)胞分化發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制。闡明其機(jī)制將有助于完善脊椎動物與人類血細(xì)胞分化發(fā)育調(diào)控機(jī)制的理論,為血液血管相關(guān)疾病的治療提供可能的治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R346
【圖文】：

統(tǒng)疾病模型：與人類一樣，斑馬魚也有先天性免疫和適應(yīng)性免疫兩種免疫系統(tǒng)，逡逑適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，Ｔ／Ｂ淋巴細(xì)胞具有免疫活性，先天性免疫系統(tǒng)，保留了邋ＴＬＲ逡逑信號通路［４１］。斑馬魚研究和疾病模型的時間表如圖１－１所示。逡逑綜上，斑馬魚己經(jīng)發(fā)展成為一個強(qiáng)大的脊椎動物模型，在胚胎發(fā)育和毒理病逡逑理以及致癌的遺傳學(xué)研宄中已顯示出重要的意義。而利用斑馬魚作為動物模型進(jìn)逡逑行大規(guī)模篩查己成為當(dāng)今科研界的研究熱點(diǎn)之一，如果在斑馬魚中建立與人類重逡逑大疾病相應(yīng)的模型并進(jìn)行病理機(jī)制研宄與藥物篩選，這將會為人類疾病的研究與逡逑治療提供更多有臨床應(yīng)用價值的信息。逡逑２逡逑

逑ＤＮＡ序列的內(nèi)切酶ＴＡＬＥＮ。但是，ＦＯＫＩ需形成二聚體才能發(fā)揮作用，這樣就逡逑大大減少了隨意剪切的幾率。核酸酶誘導(dǎo)的基因編輯原理如圖１－２所示。逡逑ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因編輯技術(shù)是２０１３年開始出現(xiàn)并迅速風(fēng)靡科研圈的基因編逡逑輯技術(shù)ｔ＃５＇邋ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)是適應(yīng)于細(xì)菌自然免疫防御系統(tǒng)的短回文重復(fù)序逡逑列（ＣＲＩＳＰＲ）－關(guān)聯(lián)蛋白９（Ｃａｓ９）系統(tǒng)，是一種位點(diǎn)特異性的基因組編輯工具，可用逡逑于真核細(xì)胞，尤其是哺乳動物細(xì)胞中特定基因組區(qū)域的定位和突變。逡逑ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)由兩個核心組分組成，Ｃａｓ９核酸酶和引導(dǎo)ＲＮＡ序列。引導(dǎo)逡逑ＲＮＡ是可以定向的。通過改變引導(dǎo)ＲＮＡ的序列，研宄人員可以精確地將Ｃａｓ９逡逑核酸酶定位到基因組中的幾乎任何一個位點(diǎn)。引導(dǎo)ＲＮＡ導(dǎo)入感興趣的細(xì)胞后，逡逑通過與相應(yīng)基因組ＤＮＡ序列的堿基互補(bǔ)配對，將Ｃａｓ９核酸酶直接導(dǎo)向靶細(xì)胞。逡逑原間隔序列相鄰基序（ＰＡＭ）的側(cè)翼ＮＧＧ邋（Ｎ為任意堿基）是ＤＮＡ序列成為合格逡逑靶標(biāo)的前提條件。一旦引導(dǎo)ＲＮＡ找到它的目標(biāo)，Ｃａｓ９核酸酶將在ＰＡＭ的幫助逡逑下從結(jié)合狀態(tài)過渡到切割狀態(tài)

圖１－４邋ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)工作的原理圖來自文獻(xiàn)＿逡逑自然存在的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系統(tǒng)將外源ＤＮＡ序列整合到ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)中，從而產(chǎn)隔序列區(qū)域（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）的ｃｒＲＮＡｓ，該區(qū)域與外源ＤＮＡ位點(diǎn)互補(bǔ)；ｃｒＲＮＡｓＡ雜交（也由ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)編碼），這對ＲＮＡ與Ｃａｓ９酶形成ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９后者識別和切割含有原間隔序列的外源ＤＮＡ。Ｂ和Ｃ為人工改造的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９由一個ｃｒＲＮＡ與部分ｔｒａｃｒＲＮＡ序列融合而成，我們成這個合成的ＲＮＡ復(fù)合體這個ｇＲＮＡ與Ｃａｓ９形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ堿基配對將ｇＲＮＡ標(biāo)互補(bǔ)區(qū)結(jié)合到特定的ＤＮＡ靶上。在野生型Ｃａｓ９存在的情況下，由于Ｃａｓ９酶活性將ＤＮＡ進(jìn)行切割，隨后啟動細(xì)胞修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，最終可能導(dǎo)致堿基失。ｇＲＮＡ序列包含３個主要區(qū)域：能夠結(jié)合Ｃａｓ９的發(fā)卡結(jié)構(gòu)、能夠特異性地ＤＮＡ的互補(bǔ)區(qū)域、轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)域。逡逑文利用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因編輯技術(shù)對ｉ／ＤＣＧ７基因進(jìn)行了敲除。逡逑

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