發(fā)布時間：2020-08-09 15:58

【摘要】：血細胞和血管的分化與發(fā)育是一個十分復雜的過程,其發(fā)育過程受一系列因子的精細調控。這些調控因子的突變或表達異常是血液和血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的內在分子病因。目前對血細胞和血管分化與發(fā)育的分子調控機制仍有待深入研究。因此,本論文的目的是研究本實驗室早期篩選的候選基因HDCG1在血細胞和血管分化與發(fā)育中的作用。本實驗室對HDCG1基因的表達研究表明,該基因在血液中高表達,提示HDCG1可能與血細胞的發(fā)育有關,但對其在血細胞分化與發(fā)育中的作用未知。為了研究該基因調控血細胞發(fā)育的生物學作用,我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術建立了斑馬魚HDCG1基因的敲除模型,并通過Western blot等實驗證明HDCG1基因的敲除模型是有效的。我們進一步通過斑馬魚胚胎整體原位雜交實驗、OD染色、蘇丹黑染色以及RT-QPCR等實驗證明,在HDCG1敲除純合體中:1)原始造血和定向造血過程中的紅系細胞標記gata1的表達水平與血紅蛋白基因hbbe1的表達水平顯著上調;2)原始造血過程中,髓系標記pu.1和mpo的表達水平幾乎不變,但L-plastin的表達水平顯著下調,造血干細胞偏髓系細胞標記cmyb和scl的表達水平下調,而造血干細胞標記runx1的表達水平幾乎不變;3)定向造血過程中,髓系標記mpo和L-plastin的表達水平輕微下調,淋巴系細胞的標記rag1的表達水平顯著上調,造血干細胞標記cmyb、scl和runxl的表達水平下調;4)O-Dianisidine染色結果表明血紅蛋白增多,蘇丹黑染色結果表明髓系粒細胞數目減少;5)血管內皮標記kdrl和fli1a與體節(jié)的標記myod1的表達水平上調;6)前腎組織標記因子cd說17和脊索標記因子shha的表達水平幾乎不變,提示HDCG1可能與前腎和脊索的發(fā)育無關。上述結果表明HDCG1在斑馬魚的原始造血和定向造血以及血管的發(fā)育過程中起著重要的調控作用。為排除胚胎原位雜交等技術研究可能出現(xiàn)的誤差,我們利用一系列的血液與血管熒光標記品 系 TG(gata1:dsred),TG(pu.1:EGFP),TG(mpo:EGFP),TG(corola:EGFP),TG(runxl:EGFP),TG(scl:EGFP),TG(cmyb:EGFP),T:G(CD41:EGFP),T:G(fli1 a:EGFP)和 TG(kdrl:mcheriy)分別與HDCG1敲除純合體雜交,分析敲除HDCG1對血液與血管標記的熒光信號變化影響,研究結果進一步支持利用胚胎原位雜交等技術獲得結果的正確性。為了證明上述研究結果確實是由敲除HDCG1基因導致的突變表型,我們合成HDCG1基因mRNA注射到HDCG1突變純合子胚胎的一細胞期細胞中,研究其是否能拯救HDCG1突變純合子導致的突變表型。研究結果證明過表達HDCG1確實能使敲除HDCG1導致的突變表型獲得拯救�？傊�,上述實驗證明,HDCG1是一個調控斑馬魚的原始造血和定向造血以及血管發(fā)育的關鍵基因。HDCG1調控斑馬魚的原始造血和定向造血以及血管的發(fā)育過程的調控機制是什么呢?前人的研究報道wnt16通過與dld/dlc相互作用調控Notch信號途徑從而調控造血干細胞的發(fā)育,HDCG1基因是不是也和Notch信號途徑有關呢?我們用原位雜交實驗檢測了 Notch信號途徑相關的分子的表達情況,結果顯示在HDCG1純合突變體中,wnt19,dld和dlc的表達水平上調,提示HDCG1基因可能通過Notch信號途徑調控造血干細胞的分化與發(fā)育。為了深入研究HDCG1基因是否還通過其他信號通路調控造血干細胞的分化與發(fā)育,我們利用敲除HDCG1基因純合突變體研究全轉錄組的表達情況,選取24hpf時期的純合突變體胚胎送去公司做轉錄組測序,HDCG1純合突變體胚胎和WT胚胎組各做三個重復。測序結果分析表明,Notch信號途徑的相關因子的表達受到不同程度的影響,其結果與胚胎原位雜交獲得的結果相同。此外,測序結果還表明:Wnt信號途徑、Jak-Stat信號途徑、Fgf信號途徑、Tgfβ信號途徑以及血液血管血紅蛋白相關因子的表達也受到不同程度的影響。為了驗證轉錄組測序的結果,我們選擇部分基因做了 QRT-PCR分析,實驗結果與全轉錄組測序得到了一致的結果,這說明HDCG1能影響多條信號通路以及和血液血管發(fā)育相關的基因的表達。為了鑒定HDCG1調控的直接靶基因,我們選擇野生型胚胎做了ChIP實驗,并將最后純化回收的總染色質送去公司進行全基因組的ChIP-Seq分析。分析結果表明,HDCG1可以結合在75個基因的promoter 上,其中 14 個基因egfl6、igsf8、slc25af8、ism1、kmt2a、st6galnac2、phkg1a、smfn、chst1、stat5b、cenpk、aggf1、uvrag 和 fam210b與血液血管的發(fā)育相關。為了驗證ChIP-Seq的結果,我們做了ChIP-PCR分析,ChIP-QPCR實驗得到的結果與ChIP-Seq結果一致。我們進一步比較轉錄組測序與ChIP-Seq結果,篩選到其表達有顯著改變的基因與ChIP-Seq結果相吻合的5個候選靶基因:egf16、igsf8、stat5b、aggf1和ism1,我們對這五個候選靶基因用RT-PCR和QRT-PCR進行表達分析,結果表明aggf1和igsf8基因在HDCG1純合突變體中的表達水平顯著上調,ism1、stat5b和egf16基因在HDCG1純合突變體中的表達水平顯著下調,與轉錄組測序的結果一致。Agf1被認為是最早調控造血干細胞分化發(fā)育的因子,在中胚層分化成成血管細胞(將來發(fā)育成造血干細胞和血管細胞)這一過程發(fā)揮作用,提示aggf1可能是HDCG1的直接靶基因,HDCG1可能是一個比aggf1還位于更早期階段的調控造血干細胞分化發(fā)育的因子;大量研究表明,stat5b是調控造血發(fā)生的主控基因,且其與許多惡性血液疾病的發(fā)生有關,我們的ChIP分析結果表明,stat5b可能是HDCG1的直接靶基因。因此,本課題接著將著重研究HDCG1如何通過aggf1和stat5b調控血細胞分化發(fā)育的分子調控機制。闡明其機制將有助于完善脊椎動物與人類血細胞分化發(fā)育調控機制的理論,為血液血管相關疾病的治療提供可能的治療靶點。
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R346
【圖文】：

統(tǒng)疾病模型：與人類一樣，斑馬魚也有先天性免疫和適應性免疫兩種免疫系統(tǒng)，逡逑適應性免疫系統(tǒng)，Ｔ／Ｂ淋巴細胞具有免疫活性，先天性免疫系統(tǒng)，保留了邋ＴＬＲ逡逑信號通路［４１］。斑馬魚研究和疾病模型的時間表如圖１－１所示。逡逑綜上，斑馬魚己經發(fā)展成為一個強大的脊椎動物模型，在胚胎發(fā)育和毒理病逡逑理以及致癌的遺傳學研宄中已顯示出重要的意義。而利用斑馬魚作為動物模型進逡逑行大規(guī)模篩查己成為當今科研界的研究熱點之一，如果在斑馬魚中建立與人類重逡逑大疾病相應的模型并進行病理機制研宄與藥物篩選，這將會為人類疾病的研究與逡逑治療提供更多有臨床應用價值的信息。逡逑２逡逑

逑ＤＮＡ序列的內切酶ＴＡＬＥＮ。但是，ＦＯＫＩ需形成二聚體才能發(fā)揮作用，這樣就逡逑大大減少了隨意剪切的幾率。核酸酶誘導的基因編輯原理如圖１－２所示。逡逑ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因編輯技術是２０１３年開始出現(xiàn)并迅速風靡科研圈的基因編逡逑輯技術ｔ＃５＇邋ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)是適應于細菌自然免疫防御系統(tǒng)的短回文重復序逡逑列（ＣＲＩＳＰＲ）－關聯(lián)蛋白９（Ｃａｓ９）系統(tǒng)，是一種位點特異性的基因組編輯工具，可用逡逑于真核細胞，尤其是哺乳動物細胞中特定基因組區(qū)域的定位和突變。逡逑ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)由兩個核心組分組成，Ｃａｓ９核酸酶和引導ＲＮＡ序列。引導逡逑ＲＮＡ是可以定向的。通過改變引導ＲＮＡ的序列，研宄人員可以精確地將Ｃａｓ９逡逑核酸酶定位到基因組中的幾乎任何一個位點。引導ＲＮＡ導入感興趣的細胞后，逡逑通過與相應基因組ＤＮＡ序列的堿基互補配對，將Ｃａｓ９核酸酶直接導向靶細胞。逡逑原間隔序列相鄰基序（ＰＡＭ）的側翼ＮＧＧ邋（Ｎ為任意堿基）是ＤＮＡ序列成為合格逡逑靶標的前提條件。一旦引導ＲＮＡ找到它的目標，Ｃａｓ９核酸酶將在ＰＡＭ的幫助逡逑下從結合狀態(tài)過渡到切割狀態(tài)

圖１－４邋ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)工作的原理圖來自文獻＿逡逑自然存在的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系統(tǒng)將外源ＤＮＡ序列整合到ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)中，從而產隔序列區(qū)域（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）的ｃｒＲＮＡｓ，該區(qū)域與外源ＤＮＡ位點互補；ｃｒＲＮＡｓＡ雜交（也由ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)編碼），這對ＲＮＡ與Ｃａｓ９酶形成ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９后者識別和切割含有原間隔序列的外源ＤＮＡ。Ｂ和Ｃ為人工改造的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９由一個ｃｒＲＮＡ與部分ｔｒａｃｒＲＮＡ序列融合而成，我們成這個合成的ＲＮＡ復合體這個ｇＲＮＡ與Ｃａｓ９形成復合物，該復合物通過Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ堿基配對將ｇＲＮＡ標互補區(qū)結合到特定的ＤＮＡ靶上。在野生型Ｃａｓ９存在的情況下，由于Ｃａｓ９酶活性將ＤＮＡ進行切割，隨后啟動細胞修復機制進行修復，最終可能導致堿基失。ｇＲＮＡ序列包含３個主要區(qū)域：能夠結合Ｃａｓ９的發(fā)卡結構、能夠特異性地ＤＮＡ的互補區(qū)域、轉錄終止子區(qū)域。逡逑文利用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９基因編輯技術對ｉ／ＤＣＧ７基因進行了敲除。逡逑

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