【摘要】：目的:日光中的紫外線(UV)是造成機(jī)體DNA損傷的常見因素。正常細(xì)胞DNA損傷后會(huì)啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù),如果損傷能夠及時(shí)修復(fù),細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù),繼續(xù)正常復(fù)制。如果損傷不能夠修復(fù),細(xì)胞有可能會(huì)走向凋亡、衰老、突變甚至癌變。RAD6B是一種泛素交聯(lián)酶E2,在DNA損傷修復(fù)及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本研究探討RAD6B在UV誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)中的作用。方法:培養(yǎng)收獲處于對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞,利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建RAD6B基因敲除細(xì)胞,免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RAD6B敲除效果。通過UV誘導(dǎo)DNA損傷。將實(shí)驗(yàn)分為四組:sgCON(陰性對(duì)照)、sgCON-UV(陰性對(duì)照+UV照射)、sgRAD6B(RAD6B敲除)、sgRAD6B-UV(RAD6B敲除+UV照射)。通過免疫熒光觀察RAD6B在UV誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)通路中的位置,Western Blotting觀察損傷因子響應(yīng)情況并探索RAD6B的底物,CCK8研究RAD6B敲除細(xì)胞對(duì)UV的敏感性,Hoechst染色從形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞的凋亡。結(jié)果:1.免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照相比,感染LV-UBE2B-sgRNA(00485-1)病毒組細(xì)胞RAD6B表達(dá)明顯降低(P0.01)。2.免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)UV照射后XPC和γH2AX在細(xì)胞核內(nèi)被招募。通過免疫印跡觀察不同劑量和時(shí)間點(diǎn)γH2AX的表達(dá),發(fā)現(xiàn)隨著UV劑量增加,γH2AX表達(dá)增加,說明隨著劑量加大細(xì)胞損傷程度也在增加,但UV劑量為15 J/m~2時(shí),γH2AX表達(dá)最高。UV(15 J/m~2)照射后隨著時(shí)間推移,γH2AX也在逐漸增加,2 h時(shí)間點(diǎn)γH2AX表達(dá)最高。通過免疫熒光檢測(cè)sgCON和sgRAD6B兩組細(xì)胞在UV照射后不同時(shí)間點(diǎn)CPD的表達(dá),結(jié)果顯示,兩組細(xì)胞在UV照射后15 min均出現(xiàn)CPD募集,但與陰性對(duì)照細(xì)胞相比,RAD6B缺陷細(xì)胞在UV照射后18 h仍能檢測(cè)到CPD表達(dá)。3.免疫熒光染色觀察到MDC1、BRCA1、53BP1與損傷標(biāo)記γH2AX在細(xì)胞核內(nèi)共定位。免疫印跡結(jié)果顯示,RAD6B敲除前后γH2AX與ERCC1在UV照射后均響應(yīng),并觀察到ERCC1由胞質(zhì)進(jìn)入胞核修復(fù)損傷。隨后我們采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)BRCA1和53BP1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,RAD6B缺陷的細(xì)胞核中BRCA1和53BP1的foci形成明顯減少(P0.01)。4.UV照射后,對(duì)照組細(xì)胞H2A的泛素化水平增加(P0.01),RAD6B缺陷細(xì)胞H2A泛素化水平下降(P0.05)。H2B在UV照射后出現(xiàn)了去泛素化(P0.01),但與對(duì)照組相比,RAD6B缺陷細(xì)胞H2B的泛素化沒有明顯差異。5.CCK8結(jié)果顯示,敲除RAD6B降低了細(xì)胞存活。Hoechst染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,RAD6B缺陷的細(xì)胞經(jīng)UV處理后凋亡細(xì)胞增多。結(jié)論:1.RAD6B參與UV誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)。2.UV誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)通路中,γH2AX、ERCC1在RAD6B上游,募集RAD6B到DNA損傷部位,招募下游DNA損傷修復(fù)因子BRCA1和53BP1。3.在UV誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)中,RAD6B可能通過泛素化組蛋白H2A、H2B以及H1.2參與損傷修復(fù)。4.RAD6B缺陷細(xì)胞對(duì)UV更加敏感,并且增加了UV誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R363
【圖文】：

圖 1.1 NER 通路圖[28]DNA 損傷在促進(jìn)細(xì)胞凋亡，衰老以及癌變方面發(fā)揮重要作用。研究表明細(xì)胞受到 DNA 損傷后，如果修復(fù)異常，就會(huì)導(dǎo)致基因突變誘發(fā)腫瘤形成。長接受紫外線照射可引發(fā)各種皮炎甚至誘發(fā)皮膚癌，因此，研究 DNA 損傷修復(fù)于預(yù)防腫瘤發(fā)生以及腫瘤治療有很大的價(jià)值[29]。1.4 DNA 損傷修復(fù)與泛素化1.4.1 泛素與泛素化泛素（Ubiquitin）是一類在所有真核細(xì)胞中表達(dá)的高度保守的含有 76 個(gè)基酸殘基的小分子蛋白質(zhì)，靶蛋白可以通過泛素間的酶促反應(yīng)而降解。泛素是指泛素分子在一系列特殊酶如泛素激活酶、交聯(lián)酶、連接酶和降解酶等作下，對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)分類，并選出相應(yīng)的靶蛋白分子，進(jìn)而特異性修飾靶蛋

學(xué)位論文 泛素交聯(lián)酶 RAD6B 在 UV 誘導(dǎo)的 DNA 損傷修復(fù)中作因此，泛素系統(tǒng)作為近年來一個(gè)重要的研究成果，它已經(jīng)成為[34]。（Ubiquitination）修飾是一個(gè)保守的多步驟過程。泛素激活 E2 和泛素連接酶 E3 三種酶參與其中（圖 1.2）。第一步，下，泛素激活酶 E1 將泛素激活。第二步，泛素從泛素激活酶聯(lián)酶 E2 活性位點(diǎn)半胱氨酸之間形成硫酯鍵。第三步，泛素泛素 Gly76 的羧基末端與底物中 Lys 的ε-氨基之間形成肽鍵而化。去泛素化酶（DUBs）從靶蛋白中去除泛素并將泛素再循]。E1、E2 和 E3 共同作用導(dǎo)致靶蛋白多泛素化，而泛素激活酶 E2 相互作用導(dǎo)致靶蛋白單泛素化。泛素化的結(jié)果就是靶向降解為較小的多肽、氨基酸等[36]。

24 3.2 RAD6B 參與 UV 誘導(dǎo)的 DNA 損傷修復(fù)。A 圖為紫外線（UV）經(jīng) 5 μm 孔徑聚碳酸膜照射（60 J/m2）293T 細(xì)胞，免疫熒光進(jìn)行 XPC 和γH2AX 染色。B 圖為細(xì)胞經(jīng)不同劑的紫外線照射，免疫印跡進(jìn)行γH2AX 定量。C 圖是對(duì) B 圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。D 圖為細(xì)胞紫外線（15 J/m2）照射后不同時(shí)間點(diǎn)通過免疫印跡進(jìn)行γH2AX 定量。E 圖是對(duì) D 圖進(jìn)行計(jì)學(xué)分析。F 圖為局部 UV 照射（60 J/m2）sgCON 細(xì)胞（上）和 sgRAD6B 細(xì)胞（下）同時(shí)間點(diǎn)后做免疫熒光進(jìn)行 CPD 染色。（*P<0.05，**P<0.01）（放大倍數(shù) 40X）

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本文編號(hào)：2782996