【摘要】：研究背景及目的膿毒癥(sepsis)是感染引起的全身炎癥反應(yīng),能導(dǎo)致臟器功能障礙。急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的病理生理機(jī)制是肺泡上皮屏障功能破壞、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,導(dǎo)致非心源性肺水腫。膿毒癥ALI可見血漿、肺組織細(xì)胞因子升高,血管及肺泡內(nèi)纖維蛋白沉積,肺毛細(xì)血管液體滲漏增加。緊密連接蛋白是維持細(xì)胞旁物質(zhì)選擇性通過、增強(qiáng)細(xì)胞屏障功能的重要成分。體外實驗發(fā)現(xiàn)緊密連接蛋白claudins、occludin、ZO-1的表達(dá)受到炎癥因子、生長因子、凝血酶等外界刺激的影響,發(fā)生表達(dá)下調(diào)或向胞漿內(nèi)移位,導(dǎo)致緊密連接功能異�；蚪Y(jié)構(gòu)破壞。肝素類藥物不僅能發(fā)揮抗凝作用,還能與炎癥因子、趨化因子、補(bǔ)體相互作用,參與機(jī)體免疫反應(yīng),產(chǎn)生抗炎作用。膿毒癥、感染性休克、膿毒癥DIC病人應(yīng)用肝素治療能降低死亡率。用普通肝素或低分子肝素處理內(nèi)毒素血癥小鼠或大鼠,能減輕炎癥反應(yīng)及器官損傷,提高生存率。目前關(guān)于緊密連接維護(hù)細(xì)胞屏障功能的研究主要涉及神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤及感染、消化道腫瘤及炎癥、呼吸系統(tǒng)炎癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變,而膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷是否有緊密連接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的參與,以及普通肝素是否通過保護(hù)緊密連接而治療膿毒癥ALI,目前尚不清楚。本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立膿毒癥大鼠ALI模型,觀察緊密連接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1是否存在表達(dá)異常,探討普通肝素是否通過保護(hù)緊密連接蛋白減輕ALI肺水腫表現(xiàn)。在體外建立人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HLMVECs)單層,研究普通肝素能否通過保護(hù)緊密連接減輕脂多糖誘導(dǎo)的HLMVECs滲漏現(xiàn)象,初步探討普通肝素的這一作用機(jī)制是否有ERK1/2 MAPK的參與。研究方法一、動物模型制備及分組45只雄性Wistar大鼠,隨機(jī)分成3組,對照組(n=15),膿毒癥組(n=15),膿毒癥肝素治療組(n=15)。對照組進(jìn)行假手術(shù),膿毒癥組、膿毒癥肝素治療組行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)。膿毒癥肝素治療組在術(shù)前30分鐘皮下注射普通肝素1000U/kg,術(shù)后12小時追加同樣劑量普通肝素一次。對照組、膿毒癥組在相同時間點皮下注射與膿毒癥肝素組等體積的生理鹽水。另取33只大鼠觀察生存率,每12小時記錄一次生存情況直至96小時。二、標(biāo)本收集及處理大鼠麻醉后,行單側(cè)支氣管肺泡灌洗,回收灌洗液,離心吸取上清,分裝后-80℃保存,用于ELISA檢測。取左肺組織測濕干重比。切取少許右肺下葉組織塊,2.5%戊二醛固定,用于透射電鏡觀察。余右肺下葉以4%多聚甲醛固定,用于石蠟切片、HE染色、免疫組織化學(xué)染色。右肺中葉以液氮速凍后,再-80℃保存,用于western blot檢測。為評價肺微血管液體滲漏情況,予大鼠靜脈注射1%伊文氏藍(lán)溶液,1小時后處死,生理鹽水灌洗肺血管后,取左肺并以超聲破碎。三、細(xì)胞培養(yǎng)方法人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HLMVECs)購自上海拜力生物科技有限公司。用DMEM高糖培養(yǎng)基(含1%青鏈霉素)+10%胎牛血清,于細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃、5%CO_2條件下培養(yǎng),每2天換液1次,培養(yǎng)3-4天處于對數(shù)生長期,且達(dá)到80-90%融合,可進(jìn)行后續(xù)實驗。用PBS、LPS、普通肝素、ERK抑制劑(U0126)分組處理細(xì)胞后進(jìn)行檢測。四、實驗方法1.動物水平(1)HE染色觀察肺組織病理表現(xiàn)。(2)ELISA檢測BALF中IL-6含量,評估肺組織炎癥反應(yīng)。(3)測肺濕干重比評估肺水腫情況。(4)測定肺組織伊文氏藍(lán)含量,評價肺微血管滲漏。(5)透射電鏡觀察肺氣血屏障。(6)Western blot檢測肺組織緊密連接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1的表達(dá)。(7)免疫組織化學(xué)觀察肺組織緊密連接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1的表達(dá)。2.細(xì)胞水平(1)跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻測定。(2)測定HLMVECs對FITC-dextran的通透系數(shù)Pd。(3)透射電鏡觀察HLMVECs緊密連接超微結(jié)構(gòu)。(4)ELISA檢測HLMVECs上清中IL-6含量(5)Western blot檢測HLMVECs緊密連接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1的表達(dá)。(6)Western blot檢測HLMVECs p-ERK1/2、ERK1/2的表達(dá)。五、統(tǒng)計學(xué)分析用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),計量資料用`X±s表示。使用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行各組間比較,再用LSD法進(jìn)行兩兩組間比較,p0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果一、普通肝素對膿毒癥大鼠急性肺損傷及緊密連接的影響1.動物模型的觀察對照組術(shù)后飲食、精神狀態(tài)、活動及反應(yīng)良好,被毛較光滑。膿毒癥組出現(xiàn)明顯精神萎靡、反應(yīng)遲緩,飲食、活動減少,呼吸頻率增加,排粘液便,被毛豎起。膿毒癥肝素治療組術(shù)后較對照組略萎靡,飲食、活動及反應(yīng)變慢,被毛不平滑,呼吸頻率稍快,但精神、反應(yīng)及活動狀態(tài)好于膿毒癥組。膿毒癥組96小時生存率最低,膿毒癥肝素治療組生存率高于膿毒癥組,對照組無動物死亡。2.肺組織病理學(xué)表現(xiàn)對照組肺泡開放,肺泡壁、肺泡隔形態(tài)清晰。膿毒癥組肺泡部分塌陷或膨脹不良,肺泡壁及肺泡隔明顯增寬,肺泡隔充血腫脹,內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤。膿毒癥肝素治療組肺泡隔腫脹增寬程度低于膿毒癥組,炎癥細(xì)胞浸潤減少。3.支氣管肺泡灌洗液中IL-6含量膿毒癥組IL-6較對照組顯著增加(27.76±4.10 vs.2.25±0.24,p0.0001),膿毒癥肝素治療組IL-6明顯低于膿毒癥組(12.50±1.65 vs.27.76±4.10,p0.0001),仍高于對照組(12.50±1.65 vs.2.25±0.24,p0.0001)。4.肺濕干重比膿毒癥組肺濕重增加,明顯高于對照組(8.906±1.598 vs.4.319±0.100,p0.0001),膿毒癥肝素治療組濕重低于膿毒癥組(5.389±0.444 vs.8.906±1.598,p0.0001),但仍高于對照組(5.389±0.444 vs.4.319±0.100,p0.0001)。5.肺組織伊文氏藍(lán)含量膿毒癥組伊文氏藍(lán)含量明顯高于對照組(44.81±5.10 vs.11.29±2.82,p0.0001),膿毒癥肝素治療組低于膿毒癥組(24.94±5.90 vs.44.81±5.10,p0.0001),但仍高于對照組(24.94±5.90 vs.11.29±2.82,p0.0001)。6.肺組織氣血屏障超微結(jié)構(gòu)觀察對照組大鼠氣血屏障結(jié)構(gòu)完整,肺泡上皮、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞無腫脹或溶解破壞。膿毒癥組肺泡上皮可見溶解破壞、邊界不清晰,血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹。膿毒癥肝素治療組肺泡上皮損傷及血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹輕于膿毒癥組。7.Western blot檢測肺組織緊密連接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1表達(dá)膿毒癥組claudin-5、occludin、ZO-1的表達(dá)明顯均低于對照組,膿毒癥肝素治療組claudin-5、occludin、ZO-1表達(dá)較膿毒癥組升高,但低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)8.免疫組織化學(xué)檢測肺組織緊密連接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表達(dá)對照組claudin-5主要表達(dá)于肺泡隔毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及胞漿邊緣,occludin、ZO-1表達(dá)于肺泡上皮、肺泡隔毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,其中occludin位于細(xì)胞膜及胞漿邊緣,ZO-1位于靠近細(xì)胞膜的胞漿內(nèi),三者呈連續(xù)、波浪線狀分布。膿毒癥組claudin-5、occludin、ZO-1在肺組織表達(dá)均降低,分布失去連續(xù)性,僅有少量散在點、片狀淺棕色染色。膿毒癥肝素治療組claudin-5、occludin、ZO-1表達(dá)高于膿毒癥組,血管內(nèi)皮或上皮細(xì)胞仍有部分呈連續(xù)、波浪狀分布,陽性染色強(qiáng)于膿毒癥組。二、普通肝素、U0126對HLMVECs FITC-dextran滲漏、緊密連接和ERK1/2 MAPK信號通路的作用1.LPS導(dǎo)致HLMVECs TEER降低LPS能導(dǎo)致HLMVECs TEER較基線降低,且隨LPS作用時間的延長,下降更明顯。LPS作用24小時,LPS5μg/ml組TEER低于對照組,但無明顯差異(p0.05),LPS10、20、50、100μg/ml組TEER均明顯低于對照組(p0.05)。2.LPS導(dǎo)致HLMVECs緊密連接蛋白表達(dá)降低LPS5μg/ml能導(dǎo)致HLMVECs緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá)明顯降低(p0.05),但對claudin-5作用不明顯(p0.05)。LPS10、20、50μg/ml均能導(dǎo)致claudin-5、occludin、ZO-1表達(dá)明顯降低(p0.05)。3.普通肝素、U0126減輕LPS誘導(dǎo)的FITC-dextran滲漏LPS(10μg/ml)組對FITC-dextran的通透系數(shù)Pd值明顯高于對照組(21.08±1.27 vs.10.89±1.87,p0.0001),LPS(10μg/ml)+肝素(10U/ml)組Pd值明顯低于LPS(10μg/ml)組(14.22±2.24 vs.21.08±1.27,p0.005)。LPS(10μg/ml)+U0126(25μM)組Pd值也明顯低于LPS(10μg/ml)組(12.84±0.57 vs.21.08±1.27,p0.005)。4.普通肝素減輕LPS導(dǎo)致的HLMVECs緊密連接超微結(jié)構(gòu)損傷對照組內(nèi)皮細(xì)胞間存在致密的、細(xì)線狀緊密連接。LPS(10μg/ml)組內(nèi)皮細(xì)胞胞漿與細(xì)胞膜交界處有大量空泡形成,細(xì)胞之間縫隙增大,緊密連接開放、斷裂,結(jié)構(gòu)不完整。LPS(10μg/ml)+肝素(10U/ml)組內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接結(jié)構(gòu)未斷裂,能封閉細(xì)胞間隙。5.普通肝素抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞IL-6釋放LPS(10μg/ml)組細(xì)胞上清中IL-6水平明顯高于對照組(p0.0001),LPS(10μg/ml)+肝素(10U/ml)組IL-6水平顯著低于LPS(10μg/ml)組(p0.0001)。6.普通肝素減輕LPS誘導(dǎo)的HLMVECs緊密連接蛋白低表達(dá)LPS(10μg/ml)組claudin-5、occludin、ZO-1表達(dá)明顯低于對照組(p0.005),LPS(10μg/ml)+肝素(10U/ml)組與LPS(10μg/ml)組比較,claudin-5、occludin、ZO-1的表達(dá)均有升高(p0.05)。7.普通肝素抑制LPS誘導(dǎo)的HLMVECs ERK 1/2 MAPK磷酸化LPS10μg/ml能誘導(dǎo)HLMVECs p-ERK1/2 MAPK表達(dá)明顯升高(p0.0001),用肝素10U/ml預(yù)處理能降低LPS導(dǎo)致的p-ERK1/2 MAPK高表達(dá)(p0.05)。8.U0126減輕LPS誘導(dǎo)的HLMVECs緊密連接蛋白claudin-5,occludin,ZO-1低表達(dá)LPS(10μg/ml)組claudin-5、occludin、ZO-1表達(dá)明顯低于對照組(p0.05),LPS(10μg/ml)+U0126(25μM)組claudin-5、occludin、ZO-1的表達(dá)均較LPS(10μg/ml)組升高(p0.05)結(jié)論1.普通肝素可能通過減輕肺組織炎癥反應(yīng)、上調(diào)緊密連接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表達(dá),減輕盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)誘導(dǎo)的大鼠膿毒癥急性肺損傷。2.普通肝素減輕LPS誘導(dǎo)的HLMVECs緊密連接超微結(jié)構(gòu)破壞,減輕HLMVECs滲漏。3.普通肝素減輕HLMVECs滲漏可能與抑制LPS誘導(dǎo)的ERK1/2 MAPK活化、上調(diào)緊密連接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R459.7;R-332
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文。膿毒癥組術(shù)后明顯萎靡、反應(yīng)遲緩，出現(xiàn)飲食及活動減少，伴有呼吸頻率增排便性狀異常，出現(xiàn)粘液便，被毛豎起、凌亂。膿毒癥肝素治療組術(shù)后較對照萎靡、飲食有減少，活動及反應(yīng)變慢，被毛不平滑，呼吸頻率稍快，精神、反活動狀態(tài)好于膿毒癥組。術(shù)后生存率最低者為膿毒癥組，膿毒癥肝素治療組生高于膿毒癥組（p<0.05），術(shù)后 96 小時膿毒癥組生存率為 41%，而膿毒癥肝素組為 63%，對照組大鼠全部存活（圖 1.1）。

3.2 肺組織的病理學(xué)表現(xiàn)對照組大鼠肺泡開放，體積形態(tài)規(guī)則，肺泡壁、肺泡隔形態(tài)清晰，厚度均勻（圖1.2A）。膿毒癥組大鼠肺泡部分塌陷或膨脹不良，肺泡壁及肺泡隔明顯增寬，肺泡間質(zhì)充血腫脹，內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤（圖 1.2B）。膿毒癥肝素治療組肺泡隔寬度大于對照組，較膿毒癥組腫脹增寬程度降低，炎癥細(xì)胞浸潤減少（圖1.2C）。膿毒癥組大鼠肺損傷評分較對照組顯著升高（p<0.0001），而膿毒癥肝素治療組肺損傷評分明顯低于膿毒癥組（p<0.0001）（圖 1.2D）。表明肝素治療減輕了膿毒癥大鼠的肺損傷病理改變。表 1.3 大鼠肺損傷評分組別 鼠數(shù)（n） 肺損傷評分對照組 3 3.25±0.87膿毒癥組 3 12.75±1.29膿毒癥肝素治療組 3 7.75±1.05

圖 1.3 大鼠支氣管肺泡灌洗液中 IL-6 含量對照組比較，IL-6 含量升高，p<0.0001。###膿毒癥肝素治療組與，p<0.0001。重比組大鼠肺濕重增加，明顯高于對照組（p<0.0001），說明膿量增加。膿毒癥肝素治療組濕重低于膿毒癥組（p<0.0001毒癥大鼠的肺水含量。表 1.5 大鼠肺濕干重比組別 鼠數(shù)（n） 濕干對照組 5 4.319膿毒癥組 5 8.906癥肝素治療組 5 5.389

【參考文獻(xiàn)】

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1 汪宗昱;吳勝楠;朱曦;;3種劑量普通肝素霧化吸入對內(nèi)毒素致肺損傷大鼠肺泡凝血和組織炎癥損傷的效應(yīng)比較[J];中國危重病急救醫(yī)學(xué);2012年10期

本文編號：2774850