【摘要】：目的:探討中藥有效成分黃芩苷單用或聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫锬さ囊种谱饔眉皺C(jī)制。方法:1.采用微量液基比濁法測(cè)定念珠菌屬的生長(zhǎng)曲線;采用微量液基稀釋法檢測(cè)黃芩苷對(duì)白念珠菌的MIC和SMIC50;通過(guò)透射電子顯微鏡觀察白念珠菌生物膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);通過(guò)碘化丙啶染色觀察白念珠菌細(xì)胞膜的損傷;通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定白念珠菌生物膜細(xì)胞周期;通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)白念珠菌生物膜細(xì)胞ROS和MMP;通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察白念珠菌生物膜細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻與流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率;通過(guò)熒光顯微鏡觀察白念珠菌生物膜細(xì)胞caspase活性;通過(guò)DAPI和TUNEL染色檢測(cè)白念珠菌生物膜細(xì)胞DNA損傷和核碎裂;通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)白念珠菌生物膜細(xì)胞Cyt C;通過(guò)q RT-PCR檢測(cè)白念珠菌生物膜氧化還原和Ras-c AMP通路相關(guān)基因表達(dá)的影響;通過(guò)Western-blot檢測(cè)白念珠菌生物膜細(xì)胞Ras-c AMP通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。2.通過(guò)棋盤(pán)法考察黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫腗IC;通過(guò)時(shí)間-殺菌曲線檢測(cè)黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫臍⒕饔?以XTT減低法和干重法檢測(cè)黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫锬ごx及干重的影響;采用掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫锬ば螒B(tài)結(jié)構(gòu)的影響;在液體和固體培養(yǎng)基觀察黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫抗芗敖湍?菌絲轉(zhuǎn)化的影響;檢測(cè)黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫锬ぜ?xì)胞表面疏水性的影響;通過(guò)HPLC檢測(cè)黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫锬ぜ?xì)胞麥角甾醇合成的影響;通過(guò)q RT-PCR檢測(cè)黃芩苷聯(lián)合氟康唑?qū)Π啄钪榫锬ず蚏as-c AMP通路相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果:1.黃芩苷對(duì)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株的MIC值介于500-1000μg/m L之間;黃芩苷誘導(dǎo)白念珠菌生物膜細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能是通過(guò)影響白念珠菌氧化還原相關(guān)基因和Ras-c AMP-PKA通路中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平,進(jìn)而影響白念珠菌生物膜細(xì)胞的細(xì)胞周期和超微結(jié)構(gòu),阻滯細(xì)胞生長(zhǎng)周期在S期、導(dǎo)致細(xì)胞核固縮和染色體片段化;引起細(xì)胞膜PS外翻;破壞線粒體代謝功能,致胞內(nèi)ROS大量累積、MMP下降、釋放Cyt C、激活caspase活性,從而誘導(dǎo)白念珠菌生物膜細(xì)胞凋亡。2.黃芩苷與氟康唑聯(lián)用抗白念珠菌的FICI介于0.28-0.5之間,表現(xiàn)為協(xié)同作用,可顯著抑制白念珠菌生物膜的形成;SEM和CLSM觀察結(jié)果驗(yàn)證了以上兩藥的協(xié)同效果。黃芩苷協(xié)同氟康唑抗白念珠菌SC5314生物膜作用的機(jī)制可能是通過(guò)影響白念珠菌黏附和菌絲相關(guān)基因、細(xì)胞表面疏水性調(diào)控基因和麥角甾醇合成調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄水平,從而抑制芽管形成及酵母-菌絲二相轉(zhuǎn)化、降低表面疏水性和影響麥角甾醇生物合成,產(chǎn)生抗白念珠菌生物膜作用。結(jié)論:黃芩苷具有較強(qiáng)的抗白念珠菌效果,其機(jī)制涉及影響白念珠菌細(xì)胞周期、引起線粒體損傷、激活凋亡依賴(lài)性信號(hào)途徑從而誘導(dǎo)白念珠菌生物膜細(xì)胞凋亡;黃芩苷亦可協(xié)同氟康唑增強(qiáng)抗白念珠菌作用,通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮協(xié)同抗白念珠菌生物膜作用。本研究為研發(fā)新型抗真菌藥物并闡明其作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R379.4
【圖文】：

圖 1 黃芩苷和氟康唑的結(jié)構(gòu)式(a) 黃芩植物；(b) 黃芩飲片；(c) 黃芩苷結(jié)構(gòu)式；(d) 氟康唑結(jié)構(gòu)式Fig 1 The photo of Scutellaria baicalensis Georgi and its decoction pieces; the structure ofbaicalin and fluconzole.(a) Scutellaria baicalensis Georgi; (b) Decoction pieces of HuangQin; (c) Baicalin ; (d) Fluconazole.

黃芩苷對(duì)白念珠菌生物膜的凋亡誘導(dǎo)作用及機(jī)制研究3.1 黃芩苷可影響念珠菌屬的生長(zhǎng)曲線本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了黃芩苷對(duì)念珠菌屬生長(zhǎng)曲線的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷濃度介于 125-1000 μg/mL 時(shí)，對(duì)念珠菌屬生長(zhǎng)曲線有不同程度的影響。在 0-12 h 內(nèi)，不同濃度的黃芩苷均能平穩(wěn)抑制四種念珠菌的生長(zhǎng)；而在 16 h 之后，不同濃度的黃芩苷對(duì)白念珠菌的生長(zhǎng)曲線影響強(qiáng)于其他三種菌。其中，1000 μg/mL 黃芩苷對(duì)四種念珠菌屬生長(zhǎng)曲線影響最明顯。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明黃芩苷對(duì)念珠菌屬均有抑制作用，其中對(duì)白念珠菌效果最顯著。3 結(jié)果

2 透射電鏡觀察黃芩苷處理后 C. albicansSC5314 生物膜細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)空白組；(b) 5 μg/mLAmB；(c) 500 μg/mL 黃芩苷；(d) 1000 μg/mL 黃芩苷. Bar, 200 n 2 Transmission electron micrographs show morphological changes characteristic of apoptoalbicans SC5314cells treated with baicalin . (a) Untreated control; (b) 5 μg/mLAmB; (c) 500mL baicalin; (d) 1000 μg/mL baicalin. Bar, 200 nm.4 黃芩苷對(duì)白念珠菌生物膜細(xì)胞的膜滲透性的影響碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種膜不透性染料，常用來(lái)標(biāo)記死細(xì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1000 μg/mL 黃芩苷只可引起 7.91%的 PI 陽(yáng)性細(xì)胞，即黃芩苷的抗icansSC5314 生物膜機(jī)制并非是通過(guò)影響細(xì)胞膜通透性。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 施高翔;嚴(yán)園園;邵菁;汪天明;汪長(zhǎng)中;;白念珠菌凋亡誘導(dǎo)研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)通報(bào);2014年02期

本文編號(hào)：2774486