發(fā)布時間：2020-07-29 20:57

【摘要】：目的:探討中藥有效成分黃芩苷單用或聯(lián)合氟康唑對白念珠菌生物膜的抑制作用及機制。方法:1.采用微量液基比濁法測定念珠菌屬的生長曲線;采用微量液基稀釋法檢測黃芩苷對白念珠菌的MIC和SMIC50;通過透射電子顯微鏡觀察白念珠菌生物膜細胞超微結構;通過碘化丙啶染色觀察白念珠菌細胞膜的損傷;通過流式細胞儀測定白念珠菌生物膜細胞周期;通過流式細胞儀檢測白念珠菌生物膜細胞ROS和MMP;通過激光共聚焦顯微鏡觀察白念珠菌生物膜細胞磷脂酰絲氨酸外翻與流式細胞儀檢測凋亡率;通過熒光顯微鏡觀察白念珠菌生物膜細胞caspase活性;通過DAPI和TUNEL染色檢測白念珠菌生物膜細胞DNA損傷和核碎裂;通過紫外分光光度計檢測白念珠菌生物膜細胞Cyt C;通過q RT-PCR檢測白念珠菌生物膜氧化還原和Ras-c AMP通路相關基因表達的影響;通過Western-blot檢測白念珠菌生物膜細胞Ras-c AMP通路相關蛋白的表達情況。2.通過棋盤法考察黃芩苷聯(lián)合氟康唑對白念珠菌的MIC;通過時間-殺菌曲線檢測黃芩苷聯(lián)合氟康唑對白念珠菌的殺菌作用;以XTT減低法和干重法檢測黃芩苷聯(lián)合氟康唑對白念珠菌生物膜代謝及干重的影響;采用掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察黃芩苷聯(lián)合氟康唑對白念珠菌生物膜形態(tài)結構的影響;在液體和固體培養(yǎng)基觀察黃芩苷聯(lián)合氟康唑對白念珠菌芽管及酵母-菌絲轉化的影響;檢測黃芩苷聯(lián)合氟康唑對白念珠菌生物膜細胞表面疏水性的影響;通過HPLC檢測黃芩苷聯(lián)合氟康唑對白念珠菌生物膜細胞麥角甾醇合成的影響;通過q RT-PCR檢測黃芩苷聯(lián)合氟康唑對白念珠菌生物膜和Ras-c AMP通路相關基因表達的影響。結果:1.黃芩苷對白念珠菌標準株和臨床分離株的MIC值介于500-1000μg/m L之間;黃芩苷誘導白念珠菌生物膜細胞凋亡的作用機制可能是通過影響白念珠菌氧化還原相關基因和Ras-c AMP-PKA通路中相關基因的轉錄水平和蛋白表達水平,進而影響白念珠菌生物膜細胞的細胞周期和超微結構,阻滯細胞生長周期在S期、導致細胞核固縮和染色體片段化;引起細胞膜PS外翻;破壞線粒體代謝功能,致胞內(nèi)ROS大量累積、MMP下降、釋放Cyt C、激活caspase活性,從而誘導白念珠菌生物膜細胞凋亡。2.黃芩苷與氟康唑聯(lián)用抗白念珠菌的FICI介于0.28-0.5之間,表現(xiàn)為協(xié)同作用,可顯著抑制白念珠菌生物膜的形成;SEM和CLSM觀察結果驗證了以上兩藥的協(xié)同效果。黃芩苷協(xié)同氟康唑抗白念珠菌SC5314生物膜作用的機制可能是通過影響白念珠菌黏附和菌絲相關基因、細胞表面疏水性調控基因和麥角甾醇合成調控基因的轉錄水平,從而抑制芽管形成及酵母-菌絲二相轉化、降低表面疏水性和影響麥角甾醇生物合成,產(chǎn)生抗白念珠菌生物膜作用。結論:黃芩苷具有較強的抗白念珠菌效果,其機制涉及影響白念珠菌細胞周期、引起線粒體損傷、激活凋亡依賴性信號途徑從而誘導白念珠菌生物膜細胞凋亡;黃芩苷亦可協(xié)同氟康唑增強抗白念珠菌作用,通過多途徑、多靶點發(fā)揮協(xié)同抗白念珠菌生物膜作用。本研究為研發(fā)新型抗真菌藥物并闡明其作用機制提供了實驗依據(jù)。
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R379.4
【圖文】：

圖 1 黃芩苷和氟康唑的結構式(a) 黃芩植物；(b) 黃芩飲片；(c) 黃芩苷結構式；(d) 氟康唑結構式Fig 1 The photo of Scutellaria baicalensis Georgi and its decoction pieces; the structure ofbaicalin and fluconzole.(a) Scutellaria baicalensis Georgi; (b) Decoction pieces of HuangQin; (c) Baicalin ; (d) Fluconazole.

黃芩苷對白念珠菌生物膜的凋亡誘導作用及機制研究3.1 黃芩苷可影響念珠菌屬的生長曲線本實驗檢測了黃芩苷對念珠菌屬生長曲線的影響，實驗結果顯示，黃芩苷濃度介于 125-1000 μg/mL 時，對念珠菌屬生長曲線有不同程度的影響。在 0-12 h 內(nèi)，不同濃度的黃芩苷均能平穩(wěn)抑制四種念珠菌的生長；而在 16 h 之后，不同濃度的黃芩苷對白念珠菌的生長曲線影響強于其他三種菌。其中，1000 μg/mL 黃芩苷對四種念珠菌屬生長曲線影響最明顯。本實驗說明黃芩苷對念珠菌屬均有抑制作用，其中對白念珠菌效果最顯著。3 結果

2 透射電鏡觀察黃芩苷處理后 C. albicansSC5314 生物膜細胞的超微結構空白組；(b) 5 μg/mLAmB；(c) 500 μg/mL 黃芩苷；(d) 1000 μg/mL 黃芩苷. Bar, 200 n 2 Transmission electron micrographs show morphological changes characteristic of apoptoalbicans SC5314cells treated with baicalin . (a) Untreated control; (b) 5 μg/mLAmB; (c) 500mL baicalin; (d) 1000 μg/mL baicalin. Bar, 200 nm.4 黃芩苷對白念珠菌生物膜細胞的膜滲透性的影響碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一種膜不透性染料，常用來標記死細實驗發(fā)現(xiàn)，1000 μg/mL 黃芩苷只可引起 7.91%的 PI 陽性細胞，即黃芩苷的抗icansSC5314 生物膜機制并非是通過影響細胞膜通透性。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 施高翔;嚴園園;邵菁;汪天明;汪長中;;白念珠菌凋亡誘導研究進展[J];微生物學通報;2014年02期

本文編號：2774486