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結(jié)核分枝桿菌Rv3407重組蛋白、DNA疫苗的制備及其免疫原性的研究

發(fā)布時(shí)間：2017-03-30 14:21

本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌Rv3407重組蛋白、DNA疫苗的制備及其免疫原性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：全世界大概有1/3的人感染結(jié)核分枝桿菌(M.tb),其中5%~10%的感染者會(huì)發(fā)展為結(jié)核病患者,因此,對(duì)結(jié)核病潛伏感染進(jìn)行有效防治至關(guān)重要�？ń槊缡悄壳邦A(yù)防結(jié)核病唯一的一個(gè)疫苗,但并不能有效地預(yù)防潛伏感染發(fā)展為結(jié)核病,其免疫效果并不十分確定,因此針對(duì)潛伏感染的疫苗的開發(fā)對(duì)于結(jié)核病的控制具有重要的意義。M.tb Rv3407是與M.tb復(fù)蘇和再激活相關(guān)的蛋白,是潛伏感染M.tb活動(dòng)的標(biāo)志。制備rv3407 DNA疫苗可能對(duì)潛伏的M.tb有免疫清除作用,抑制M.tb的復(fù)燃,對(duì)潛伏感染人群具有免疫保護(hù)作用。因此,有可能成為一種新型的針對(duì)潛伏感染的候選疫苗,為結(jié)核病的預(yù)防和控制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析Rv3407蛋白的抗原表位,了解其抗原性;應(yīng)用分子克隆技術(shù)制備了Rv3407重組蛋白;構(gòu)建了rv3407DNA疫苗,并評(píng)價(jià)了該疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫原性。一、結(jié)核分枝桿菌Rv3407蛋白抗原表位的預(yù)測(cè)利用DNAStar軟件包中Protean軟件對(duì)Rv3407氨基酸序列進(jìn)行分析,采用包括二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、抗原性、可及性、柔韌性、電荷分布等多參數(shù)預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)及T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位。利用SYFPEITHI和RANKPEP在線遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)其Th細(xì)胞表位。利用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法和NetCTL在線遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)其CTL表位。結(jié)果顯示Rv3407蛋白具有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)和多處抗原指數(shù)較高的區(qū)段,潛在的B細(xì)胞抗原表位較多,可能位于11~26、28~43、50~61、66~74、76~99位氨基酸殘基或其附近,這些區(qū)域基本上含有β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu),親水性、表面可能性和柔韌性指數(shù)都較高。該蛋白潛在的T細(xì)胞抗原表位也較多,可能位于2~12、22~26、34~37、40~44、56~60、75~79、86~93位氨基酸殘基或其附近。綜合syfpeithi和rankpep預(yù)測(cè)結(jié)果,共篩選出hla-drb1*0101、hla-drb1*0301、hla-drb1*0401、hla-drb1*0701、hla-drb1*0801、hla-drb1*1101、hla-drb1*1501表型評(píng)分在23分以上或有意義的th候選表位22個(gè)。綜合分析blast比對(duì)結(jié)果及syfpeithi、bimas和netctl的預(yù)測(cè)結(jié)果,結(jié)果顯示rv3407蛋白抗原在hla-a*0201、hla-a*03和hla-b7評(píng)分在18分以上或有意義的限制性ctl候選表位共有20個(gè)。二、結(jié)核分枝桿菌rv3407的克隆、表達(dá)、純化通過(guò)pcr擴(kuò)增rv3407基因,以質(zhì)粒pet30a為表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3),以iptg誘導(dǎo)基因工程菌表達(dá)目的蛋白,通過(guò)sds-page電泳鑒定pet30a-rv3407在大腸桿菌中的表達(dá),確定pet30a-rv3407蛋白抗原在大腸桿菌中的表達(dá)形式。采用proteinisoni-ntaresin純化重組蛋白。結(jié)果顯示rv3407基因擴(kuò)增成功;重組質(zhì)粒pet30a-rv3407構(gòu)建成功,測(cè)序結(jié)果與報(bào)道序列相同,在大腸桿菌中以可溶性形式表達(dá)。蛋白分子量約11kda,純化得到目的蛋白。三、結(jié)核分枝桿菌rv3407dna疫苗的制備以h37rv基因組為模板,將rv3407基因進(jìn)行pcr,擴(kuò)增產(chǎn)物回收后連接入克隆載體pgem-t中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α,pcr鑒定及測(cè)序鑒定正確后提取質(zhì)粒pgem-t-rv3407,經(jīng)nheⅠ和ecorⅠ雙酶切鑒定正確后,大量雙酶切凝膠回收rv3407基因片段,與同樣經(jīng)nheⅠ和ecorⅠ雙酶切的真核表達(dá)載體pvax1通過(guò)t4dna連接酶相連接,進(jìn)而轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α,篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行pcr鑒定及測(cè)序鑒定正確,證明真核表達(dá)質(zhì)粒pvax1-rv3407構(gòu)建成功。應(yīng)用qiagen質(zhì)粒大提試劑盒大量提取質(zhì)粒dna。將質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞,提取rna后用toyobo反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄,進(jìn)行pcr,擴(kuò)增出約318bp的rv3407基因片段,證明在轉(zhuǎn)錄水平有rv3407的表達(dá)。四、結(jié)核分枝桿菌rv3407dna疫苗免疫原性的研究將50只雌性balb/c小鼠隨機(jī)分為下列5組:滅菌注射用水組、載體質(zhì)粒pVAX1 DNA組、微卡菌苗組、Ag85A DNA疫苗組、rv3407DNA疫苗組,每組10只,通過(guò)雙側(cè)脛前肌注射的方法免疫小鼠,每2周1次,共3次,第3次免疫后3周殺死小鼠。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)小鼠全血內(nèi)Th1、Th2細(xì)胞百分比及Th1/Th2比值,Tc1、Tc2細(xì)胞百分比及Tc1/Tc2比值;通過(guò)ELISA方法檢測(cè)血清中抗Rv3407抗體IgG;通過(guò)ELISA方法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平。流式結(jié)果顯示rv3407 DNA疫苗組Th1細(xì)胞百分比顯著高于滅菌注射用水組、載體組和微卡組(p0.01),與Ag85A DNA疫苗組無(wú)顯著性差異;Th2細(xì)胞百分比較滅菌注射用水組、微卡組和Ag85A DNA疫苗組低,但無(wú)顯著性差異;Th1/Th2細(xì)胞比值顯著高于滅菌注射用水組、載體組和微卡組(p0.01),與Ag85A DNA疫苗組無(wú)顯著性差異;Tc1細(xì)胞百分比高于滅菌注射用水組、載體組和微卡組,但無(wú)顯著性差異;Tc2細(xì)胞百分比各組間無(wú)顯著性差異;Tc1/Tc2細(xì)胞比值高于滅菌注射用水組、載體組和微卡組,但無(wú)顯著性差異。ELISA結(jié)果顯示rv3407 DNA疫苗組和Ag85A DNA疫苗組小鼠特異性抗體Ig G水平顯著高于滅菌注射用水組、載體質(zhì)粒組和微卡菌苗組(p0.01)。脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ檢測(cè)結(jié)果顯示3/10 rv3407 DNA疫苗組和1/10載體組小鼠產(chǎn)生高水平的IFN-γ,而滅菌注射用水組、和微卡組沒有小鼠產(chǎn)生IFN-γ。綜上所述,結(jié)核分枝桿菌Rv3407蛋白是個(gè)T細(xì)胞、B細(xì)胞抗原表位都較豐富的抗原;成功地制備了Rv3407重組蛋白和rv3407 DNA疫苗;rv3407 DNA疫苗可誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)和Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng),具有較好的免疫原性,將進(jìn)一步研究其抗結(jié)核作用。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 Rv3407 抗原表位 重組蛋白 DNA疫苗 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392-33
【目錄】：