【摘要】：金屬元素鎘是分布廣泛的環(huán)境污染物。鎘經(jīng)消化道或呼吸道進(jìn)入機(jī)體后,在多個(gè)器官中蓄積,并引起急性或慢性損傷。肝臟是鎘蓄積和損傷的重要靶器官之一,近些年研究發(fā)現(xiàn),鎘能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬,并且適當(dāng)?shù)淖允墒羌?xì)胞抵抗鎘毒性損傷的保護(hù)機(jī)制。葛根素是中草藥葛根中的主要化學(xué)成分,具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等多種功效。研究發(fā)現(xiàn),葛根素能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,減輕鎘引起的細(xì)胞損傷,但其具體機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)以小鼠正常肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)氯化鎘與葛根素單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞,利用細(xì)胞分子生物學(xué)相關(guān)方法,探究鎘暴露對(duì)肝細(xì)胞自噬與溶酶體功能的影響及葛根素的保護(hù)效應(yīng),為進(jìn)一步揭示鎘的毒性機(jī)制以及鎘中毒防治提供理論依據(jù)。1.葛根素對(duì)鎘致AML12細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng)為了探討葛根素在鎘致AML12細(xì)胞損傷中的作用,本研究通過(guò)鎘與葛根素單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞,用xCELLigence細(xì)胞實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)(Real-time cell analysis,RTCA)檢測(cè)細(xì)胞指數(shù)(Cell index,CI),倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),Hoechst 33258熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài),透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,鎘暴露引起AML12細(xì)胞損傷,主要表現(xiàn)為抑制CI上升速度;引起細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞核形態(tài)改變;破壞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。葛根素能夠緩解鎘引起的上述損傷。2.鎘對(duì)AML12細(xì)胞自噬的影響及葛根素的保護(hù)效應(yīng)為了探究自噬在鎘致AML12細(xì)胞損傷中的作用,以及葛根素的保護(hù)作用。本試驗(yàn)以5 μM鎘與200μM葛根素單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞12 h,透射電子顯微鏡觀察自噬小體變化,MDC熒光染色觀察自噬水平變化,免疫熒光法觀察LC3聚點(diǎn)變化;5μM鎘處理細(xì)胞不同時(shí)間(0、3、6、12、24 h)、不同濃度鎘(0、2.5、5、10μM)處理細(xì)胞12 h,免疫印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin-1、LC3Ⅱ、P62的表達(dá)水平;5 μM鎘分別與50 nM Bafilomycin A1(Baf)、200μM葛根素單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞12h,免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞自噬流變化;5μM鎘分別與50 nM Baf、50 nM RAPA單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞,RTCA監(jiān)測(cè)CI變化。結(jié)果表明,鎘誘導(dǎo)AML12細(xì)胞自噬水平升高,且在5 μM鎘處理細(xì)胞12 h時(shí),自噬水平最高(P0.01);鎘暴露引起細(xì)胞自噬流阻滯,自噬流阻滯加劇了鎘對(duì)細(xì)胞的毒性損傷;葛根素可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬,緩解鎘引起的自噬流阻滯,進(jìn)而對(duì)鎘引起的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)效應(yīng)。3.鎘對(duì)AML12細(xì)胞溶酶體功能的影響及葛根素的保護(hù)效應(yīng)為了探討鎘致AML12細(xì)胞自噬流阻滯的可能機(jī)制,以及葛根素的保護(hù)效應(yīng),本試驗(yàn)以5μM鎘處理細(xì)胞不同時(shí)間(0、3、6、12、24 h)、不同濃度鎘(0、2.5、5、10、20 μM)處理細(xì)胞12 h、5 μM鎘與200 μM葛根素單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞12 h,通過(guò)Lyso-Tracker Red(LTR)熒光染色,觀察細(xì)胞溶酶體酸性環(huán)境的變化;免疫印跡法檢測(cè)溶酶體相關(guān)膜蛋白2(Lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)、組織蛋白酶 B(Cathepsin B,CTSB)以及Rab7的表達(dá)。5 μM鎘與200 μM葛根素單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞12 h、Baf處理細(xì)胞12 h、EBSS處理細(xì)胞12 h,通過(guò)DQ-BSA-Green降解實(shí)驗(yàn),檢測(cè)溶酶體降解功能。50 nM RAPA單獨(dú)處理細(xì)胞 12 h、5 μM 鎘分別與 200 μM 葛根素、50 nM Thapsigargin(TG)、50 nM Baf單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞12 h,免疫熒光法觀察LAMP2與LC3共定位情況。結(jié)果表明,鎘暴露引起AML12細(xì)胞溶酶體活化,主要表現(xiàn)為溶酶體酸化、LAMP2與CTSB的表達(dá)增加;鎘促進(jìn)溶酶體降解功能但導(dǎo)致LAMP2與LC3共定位減少;此外,鎘抑制Rab7的表達(dá),且呈時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系;葛根素與鎘共處理可進(jìn)一步促進(jìn)溶酶體活化,有效恢復(fù)LAMP2與LC3共定位并增加Rab7的表達(dá)。綜上所述,鎘暴露引起AML12細(xì)胞損傷,并促進(jìn)細(xì)胞自噬,同時(shí)引起自噬流阻滯,自噬流阻滯進(jìn)一步加劇鎘暴露對(duì)細(xì)胞的毒性損傷;鎘誘導(dǎo)AML12細(xì)胞溶酶體活化,促進(jìn)溶酶體降解功能,抑制溶酶體與自噬體融合;此外,鎘抑制調(diào)控溶酶體與自噬體融合的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ap7的表達(dá);葛根素可促進(jìn)AML12細(xì)胞自噬,可緩解鎘引起的細(xì)胞損傷,其內(nèi)在機(jī)制可能與葛根素恢復(fù)自噬體與溶酶體融合,恢復(fù)Rab7的表達(dá),進(jìn)而緩解鎘引起的自噬流阻滯有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R-332;R595.2
【圖文】：

能夠清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以及脂滴，并釋放質(zhì)供細(xì)胞循環(huán)利用。此外，自噬也能夠清除細(xì)胞內(nèi)的病原體，因此，自噬也被認(rèn)為的一種生存機(jī)制［８￣。自噬在生理狀態(tài)與病理狀態(tài)下均可發(fā)生，細(xì)胞處于饑餓、缺氧刺激、病原入侵以及其他方式對(duì)細(xì)胞造成應(yīng)激的狀態(tài)下，自噬可被快速激活，清除物為細(xì)胞提供能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在維持細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器與蛋白質(zhì)的完整性以及免疫調(diào)揮重要調(diào)節(jié)作用［８５，８６］。逡逑如圖１－２－１所示，自噬可分為分子伴侶自噬、微自噬以及巨自噬。分子伴侶自于待降解底物的特定序列（ＫＦＥＲＱ）與分子伴侶熱休克相關(guān)蛋白７０邋（ＨＳＰ７０）的識(shí)合，具有高度選擇性。被識(shí)別后的底物最終與溶酶體膜上的受體蛋白ＬＡＭＰ－２Ａ結(jié)溶酶體融合進(jìn)行降解［８６］。與分子伴侶自噬相比，微自噬的過(guò)程要相對(duì)簡(jiǎn)單，微自噬自噬體的參與，對(duì)降解底物沒(méi)有選擇性。微自噬是溶酶體膜內(nèi)陷直接捕獲受損細(xì)胞可溶性蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)入溶酶體降解的過(guò)程。但在真核細(xì)胞中微自噬很少發(fā)生，介導(dǎo)微自機(jī)制尚不明確［８７］。巨自噬是真核細(xì)胞中普遍存在的自噬方式，受多種基因調(diào)控，由節(jié)組成，是最復(fù)雜也是最具自噬特征性的自噬方式［８８＃。巨自噬通常被簡(jiǎn)稱為自。逡逑

０邐揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑范圍，檢測(cè)ＣＩ的變化。結(jié)果如圖２－１－１所示，ＣＩ達(dá)到２．５？３時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，逡逑速生長(zhǎng)期是處理細(xì)胞的最佳時(shí)期，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)為了方便安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間，最終選擇逡逑孔接種１．２Ｘ１０４個(gè)細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，待ＣＩ達(dá)到２．５？３時(shí)處理細(xì)胞。逡逑－５０００邋１邐＊邋＊邋——１邋？邐Ｉｌｌｌ－ｉ－邋ＩＩ邋ＭｌｉｌｌｌｌｌＪｉｉｈｎｔ邋．ｎｍｉｌＭ邋ｉｎｉｌ－邋ＭＰ邋ｍｎ－邋；邋？逡逑．．

２－１－５Ａ）。與Ｃｏｎｔｒｏｌ組相比，Ｐｕｅ組細(xì)胞增殖速度與細(xì)胞形態(tài)無(wú)顯著差異，Ｃｄ單獨(dú)處理組逡逑細(xì)胞X椫乘俁燃躉�，细胞形态变化灭媹A⒊魷炙勞魷赴揮耄茫淶ザ來(lái)磣橄啾齲校酰逵脲義希茫涔泊磣�，细胞形态变化优d航猓ㄍ跡玻保靛澹攏�。提是G茫湟鸕模粒停蹋保蠶赴鶘順叔義鮮奔洌亮啃в叵擔(dān)校酰蹇苫航猓茫湟鸕南赴鶘�，与＿b裕茫練從車(chē)慕峁恢�。辶x希玻掣鷥卦陲又?jǐn)n粒停蹋保蠶赴誦翁鶘酥械謀；ぷ饔緬義媳臼匝榻岷瞎鄄煜赴誦翁謀浠徊教教鄭茫渲?jǐn)n粒停蹋保蠶赴拘運(yùn)鶘思埃校酰邋義系謀；ぷ饔謾２煌ǘ

本文編號(hào)：2768026