【摘要】：【目的】micro RNAs(mi RNAs)是一種內(nèi)源性18~26 nt的單鏈非編碼小分子RNA,在動植物體內(nèi)通過靶定編碼基因m RNA 3’UTR區(qū)域直接進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控從而發(fā)揮其基因表達(dá)調(diào)控功能。已有研究表明宿主細(xì)胞mi RNAs參與了病毒感染后的抗病毒免答效應(yīng),另一方面病毒感染還可引起宿主細(xì)胞內(nèi)mi RNAs的表達(dá)升高或降低,宿主細(xì)胞mi RNAs與病毒感染之間存在著密切的相關(guān)性。本項目前期實驗結(jié)果表明HSV-1感染He La細(xì)胞后mi R-101表達(dá)水平顯著升高,并且初步確定mi R-101通過直接靶定并下調(diào)COX2(Cyclooxygenase 2)和GRSF1(G-rich RNA sequence binding factor 1)可能對HSV-1的復(fù)制產(chǎn)生影響。成熟的mi R-101有兩個前體,為pre-mi R-101-1和pre-mi R-101-2,分別位于1號和9號染色體上,本實驗室前期工作證明HSV-1感染后mi R-101的表達(dá)水平升高,以pre-mi R-101-2來源為主。因此本文擬從HSV-1誘導(dǎo)hsa-mi R-101-2表達(dá)升高的現(xiàn)象出發(fā),深入研究HSV-1感染后宿主細(xì)胞hsa-mi R-101-2顯著升高的具體機(jī)制,以及mi R-101對HSV-1復(fù)制的具體調(diào)控作用機(jī)制,深入闡明宿主細(xì)胞mi RNA與HSV-1之間的相互作用關(guān)系。【方法】本文主要從HSV-1感染后宿主細(xì)胞mi R-101顯著升高的具體機(jī)制,以及mi R-101對HSV-1復(fù)制的具體調(diào)控作用機(jī)制兩方面進(jìn)行:1.首先通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗確定HSV-1對hsa-mi R-101-2啟動子的具體作用方式,確定導(dǎo)致hsa-mi R-101-2啟動子活性變化的HSV-1編碼的作用因子。然后通過q RT-PCR實驗檢測該作用因子對hsa-mi R-101-2及其宿主基因表達(dá)水平的影響,進(jìn)一步確定該作用因子對hsa-mi R-101-2的具體調(diào)控方式。最后通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗,凝膠電泳遷移實驗確定作用因子是否作為轉(zhuǎn)錄因子與hsa-mi R-101-2啟動子發(fā)生直接或間接的相互作用。2.首先通過病毒滴定,免疫熒光,western blot等實驗進(jìn)一步確定mi R-101的直接靶基因COX2和GRSF1對HSV-1復(fù)制的具體作用。然后通過q RT-PCR確定COX2對干擾素表達(dá)水平的影響;并通過western blot,RNA免疫共沉淀及凝膠電泳遷移實驗確定GRSF1促進(jìn)HSV-1衣殼蛋白表達(dá)的具體作用方式,最終確定COX2和GRSF1影響HSV-1復(fù)制的具體分子途徑�！窘Y(jié)果】1.雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗結(jié)果表明HSV-1感染后,hsa-mi R-101-2啟動子活性顯著增強(qiáng);2.雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗結(jié)果表明過表達(dá)HSV-1即刻早期蛋白ICP4可以促進(jìn)hsa-mi R-101-2啟動子活性,q RT-PCR實驗結(jié)果顯示過表達(dá)ICP4可以促進(jìn)hsa-mi R-101-2及其宿主基因的表達(dá);3.染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(Ch IP)及凝膠電泳遷移實驗(EMSA)結(jié)果表明ICP4可以直接結(jié)合hsa-mi R-101-2啟動子序列;4.病毒滴定實驗,免疫熒光實驗,western blot實驗結(jié)果表明GRSF1可以促進(jìn)HSV-1復(fù)制,而COX2可以抑制HSV-1復(fù)制;5.qRT-PCR實驗結(jié)果表明COX2可以促進(jìn)I/III型干擾素的表達(dá);6.Western blot實驗結(jié)果表明GRSF1可以促進(jìn)HSV-1衣殼蛋白p40的表達(dá)水平;7.RNA免疫共沉淀實驗及RNA凝膠電泳遷移實驗結(jié)果表明GRSF1可以與p40的m RNA直接結(jié)合�！窘Y(jié)論】通過對本課題的深入研究,具體可以得到以下3個結(jié)論:1、HSV-1通過其即刻早期蛋白ICP4誘導(dǎo)hsa-mi R-101-2的表達(dá)升高,ICP4可以直接結(jié)合hsa-mi R-101-2啟動子序列并作為轉(zhuǎn)錄因子激活其轉(zhuǎn)錄活性。2、mi R-101的直接靶基因COX2可以通過促進(jìn)I/III型干擾素的表達(dá)從而抑制HSV-1的復(fù)制。3、mi R-101的直接靶基因GRSF1可以通過結(jié)合HSV-1衣殼蛋白p40的mRNA促進(jìn)其翻譯表達(dá),從而促進(jìn)HSV-1的復(fù)制。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373
【圖文】：

1.2 結(jié)果1.2.1 HSV-1 誘導(dǎo) hsa-miR-101-2 啟動子轉(zhuǎn)錄活性升高本實驗室前期工作證明 HSV-1 感染后 miR-101 的表達(dá)水平升高，以pre-miR-101-2 來源為主，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn) pre-miR-101-2 與其宿主基因 RCL1 表達(dá)呈正相關(guān)，表明其具有相同啟動子。本實驗室前期工作已經(jīng)成功構(gòu)建hsa-miR-101-2 啟動子序列(圖 1)，并證明其具有啟動子活性。前期工作中我們構(gòu)建了多段啟動子序列，在此我們選擇了 p1060，p421，p334 為研究對象，作深入分析(圖 1)。

圖 2 HSV-1 促進(jìn) hsa-miR-101-2 啟動子活性的確定在 HeLa 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染啟動子質(zhì)粒，12 h 后感染 HSV-1 病毒(MOI=0.01)，雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗檢測熒光素酶活性。A. 病毒感染 4 h 后 hsa-miR-101-2 啟動子熒光素酶活性。B. 病毒感染 8 h 后 hsa-miR-101-2 啟動子熒光素酶活性。C. 病毒感染 24 h 后 hsa-miR-101-2 啟動子熒光素酶活性。*，p<0.05，**，p<0.01。每組設(shè)有三個復(fù)孔。1.2.2 ICP4 誘導(dǎo) hsa-miR-101-2 啟動子轉(zhuǎn)錄活性及其表達(dá)水平升高前期實驗結(jié)果表明 HSV-1 感染早期 miR-101 的表達(dá)顯著升高，并且可以促進(jìn) hsa-miR-101-2 的啟動子活性，因此我們擬深入研究分析 HSV-1 編碼的蛋白中可能的相關(guān)調(diào)控因子，并且將目標(biāo)選定在 HSV-1 編碼的即刻早期蛋白范圍內(nèi)，通過參考文獻(xiàn)及相關(guān)生物信息學(xué)分析，我們選擇了 HSV-1 的即刻早期蛋白 ICP4作為研究對象，進(jìn)一步研究 HSV-1 是否通過 ICP4 直接調(diào)控 hsa-miR-101-2 的表達(dá)。首先我們應(yīng)用基因克隆的方法分別構(gòu)建了 ICP4 過表達(dá)和干擾質(zhì)粒。

EcoR I 之間連入三連 Flag (3×Flag)標(biāo)簽，在 EcoR I 和 Xho I 中間插入 PCR 擴(kuò)增所得 ICP4 CDS 序列 (3.9 kb) (圖 3A)。通過單酶切鑒定有 9.3 Kb 左右的酶切片段(載體和目的片段全長) (圖 3B)，并經(jīng)測序公司測序后與其 CDS 序列比對正確，證明 pcDNA3-3×Flag/ICP4(以下簡稱 pFlag-ICP4)質(zhì)粒構(gòu)建成功。將pFlag-ICP4 及其對照 pcDNA3 轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 48h 裂解蛋白，western blot檢測其蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，pFlag-ICP4 可以有效表達(dá) ICP4， (圖 3C)。證明 ICP4 過表達(dá)質(zhì)粒有效，可以進(jìn)行下一步實驗。

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2758671