【摘要】：目的:提取并鑒定人脂肪干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells,ADSCs)不同成骨分化階段的外泌體(hADSC-Exos),探究hADSC-Exos促進(jìn)成骨分化的適宜提取時(shí)間及作用濃度,證明其能夠進(jìn)入hADSCs內(nèi)進(jìn)行調(diào)控。研究方法:酶消化法分離培養(yǎng)原代hADSCs并進(jìn)行鑒定;超速離心法提取hADSCs未成骨誘導(dǎo)(Exo0),成骨誘導(dǎo)1~14d(Exo14)及15~28d(Exo28)的外泌體,并采用透射電鏡,Western Blot,動(dòng)態(tài)光散射法進(jìn)行鑒定;使用茜素紅染色檢測(cè)比較3種hADSC-Exos促進(jìn)原始hADSCs成骨分化的能力;PKH67標(biāo)記Exo14檢測(cè)hADSCs對(duì)其攝取的能力;CCK-8和劃痕法分別檢測(cè)三種不同濃度(10、15、20μg/ml)Exo14對(duì)hADSCs增殖及遷移能力的影響;Western Blot檢測(cè)不同濃度Exo14對(duì)hADSCs成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的作用。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)所獲取的hADSCs符合間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn)。透射電鏡及動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果表明所獲取的外泌體具有典型的外泌體形態(tài)特征,Western Blot檢測(cè)外泌體CD63,CD9呈陽(yáng)性表達(dá)。茜素紅染色表明培養(yǎng)21d后,Exo14組礦化結(jié)節(jié)含量明顯高于Exo28組。PKH67標(biāo)記的外泌體能夠被hADSCs攝取進(jìn)入細(xì)胞,聚集在細(xì)胞核周?chē)�。CCK-8表明培養(yǎng)24h,48h外泌體對(duì)細(xì)胞增殖能力無(wú)影響,至72h,15μg/mlExo14明顯促進(jìn)hADSCs增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)表明培養(yǎng)至12h外泌體組明顯高于陰性對(duì)照PM組(P0.01),且隨外泌體濃度增加促細(xì)胞遷移能力呈遞減趨勢(shì)但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)意義(P0.05)。Western Blot檢測(cè)共培養(yǎng)3d,Exo14組成骨相關(guān)蛋白ALP,RUNX2呈陽(yáng)性表達(dá),結(jié)果表示15μg/mlExo14組促RUNX2表達(dá)能力與成骨誘導(dǎo)液組(陽(yáng)性對(duì)照組)相當(dāng),蛋白表達(dá)明顯高于10μg/mlExo14組(0.583±0.045)和20μg/mlExo14(0.499±0.010)。結(jié)論:hADSCs成骨誘導(dǎo)1~14d分泌的外泌體Exo14能夠被原始的hADSCs高效攝取并且進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立作用誘導(dǎo)hADSCs成骨分化。較低濃度的Exo14即可促進(jìn)hADSCs增殖,遷移,成骨分化,并且最適宜作用濃度為15μg/ml。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 hADSCs 形態(tài)學(xué)觀察原代 hADSCs 接種 48h 后基本貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞由圓形伸展為長(zhǎng)梭形或多角形（圖 1A）。傳至 4 代可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，融合達(dá) 80%以上，細(xì)胞呈集落式旋渦狀生長(zhǎng)，大小均一，排列緊密，邊緣清晰（圖 1B）AB

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3.3 hADSCs 多向分化能力鑒定hADSCs 成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞呈復(fù)層聚集生長(zhǎng)，逐漸變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形，表面突起增加連接鄰近細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)黑色顆粒，細(xì)胞間可見(jiàn)礦化的基質(zhì)。誘導(dǎo)21d后茜素紅染色可見(jiàn)大量紅色礦化結(jié)節(jié)hADSCs成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞逐漸變?yōu)闄E圓形，體積增大，誘導(dǎo) 14d 后油紅 O 染色可見(jiàn)較多亮紅色的聚集圓形脂滴；hADSCs成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞逐漸變?yōu)閳A形，誘導(dǎo) 28d 后阿利辛藍(lán)染色可見(jiàn)軟骨組織中呈藍(lán)色的內(nèi)酸性粘多糖。A B C

圖 4.人脂肪干細(xì)胞來(lái)源外泌體電鏡鑒定A：黑色箭頭所指為Exo0（6000X）；B:黑色箭頭所指為Exo14（4000X）;C:黑色箭頭所指為Exo28（4000X）。圖中Exo0:hADSCs未分化階段分泌的外泌體；Exo14：hADSCs成骨分化 1~14d分泌的外泌體；Exo28:hADSCs成骨分化 15~28d分泌的外泌體。3.5 hADSCs-Exos 粒徑分析使用馬爾文粒度儀動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)量納米顆粒粒徑，結(jié)果顯示 hADSCs-Exos平均直徑為 125.8nm,粒度分布系數(shù)（polydispersity indexes，PDI）為 0.282，結(jié)果質(zhì)量良好，符合外泌體粒徑標(biāo)準(zhǔn)。

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本文編號(hào)：2754205