【摘要】：研究背景:自從1995年后,間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)在臨床試驗中被廣泛使用。它們具有細胞的三種性能:(1)具有粘附能力,在進行細胞培養(yǎng)時,MSCs可貼壁生長;(2)MSCs表達CD29、CD73、CD90 以及 CD105 等標志物,不表達 CD34、CD45、CD14、CD19和人白細胞抗原Ⅱ類(Human leukocyte antigen,HLA)等標志物;(3)具有多向分化的潛能,可向多個細胞系分化,如:神經(jīng)元細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、胰島樣細胞和纖維母細胞,能夠替代原有損傷的細胞和組織。已有文獻報道,MSCs在人體內(nèi),無論是動物體內(nèi),還是大鼠體內(nèi),能夠分化為多巴胺(Dopamine,DA)神經(jīng)元。大量的研究已經(jīng)顯示,MSCs在細胞治療的領(lǐng)域具有巨大的潛在效應,可作為一種新的治療手段,在一定程度上能治療許多目前無法治愈的疾病,包括心臟病、神經(jīng)元退行性疾病、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、自身免疫性疾病等。此外,MSCs還廣泛用于治療各種疾病動物模型的研究中,如:麻醉所致的脊髓損傷、風濕性疾病、創(chuàng)傷修復的治療和骨骼肌的重建等。帕金森病是全球第二大神經(jīng)退行性疾病,主要病理生理機制為中腦黑質(zhì)(substantia nigra,SN)多巴胺神經(jīng)元進行性變性死亡,促發(fā)一系列炎癥反應,并引起惡性循環(huán),導致DA生成障礙,殘存的神經(jīng)元胞內(nèi)出現(xiàn)Lewy小體。PD起病隱襲,其核心癥狀為運動癥狀,以靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢步態(tài)障礙等主要表現(xiàn),同時伴隨非運動癥狀,主要包括感覺異常、精神癥狀、睡眠障礙、自主神經(jīng)功能障礙。目前仍缺乏有效的治愈手段,因此尋求行而有效的PD治療手段極為重要。迄今普遍認為,6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)損毀帕金森大鼠模型和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)誘導帕金森小鼠模型是比較完善的PD動物模型。6-OHDA損毀PD大鼠模型行為變化穩(wěn)定可靠且持續(xù)時間長,可采用運動反應時間、步態(tài)調(diào)整和爪回縮、樓梯和固定棒擠壓等實驗對大鼠的運動起始不能、控制僵直等方面進行定量測試,更適合用于PD的細胞移植、基因治療、臨床前藥物研究、藥理療效判定和神經(jīng)保護等方面的研究。我們嘗試把PBMSCs注射入PD大鼠模型腦內(nèi),并評估PBMSCs對多巴胺神經(jīng)元產(chǎn)生的效應。然而,僅有MSCs的效應是不明顯的。對于促進MSCs療法的功效,醫(yī)學科學研究具有重要意義。MSCs治療是PD細胞治療的熱點之一,基因修飾MSCs更是PD治療的新興方向,以MCSs作為有效的基因載體,用特定的單個或多個基因修飾,移植入腦內(nèi)以達到治療PD的療效。國內(nèi)外己有學者把基因治療與干細胞移植的治療方法用于PD模型動物中,并取得一定的可喜的成效。目前尚無NTRK1修飾的PBMSCs對PD模型大鼠的效應。神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸受體激酶1(Neurotrophic tyrosine receptor kinase 1,NTRK1)是神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)高親和力的受體,NGF主要通過NTRK1發(fā)揮生物學效應。NGF是一種信號蛋白,是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子,具有營養(yǎng)神經(jīng)元和促突起生長的生物學功能,它對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調(diào)控作用。上述生物學效應的產(chǎn)生需要其與特異性受體NTRK1結(jié)合。據(jù)報道稱,在NGF刺激下,NTRK1表達升高會增加神經(jīng)干細胞向膽堿能神經(jīng)元的分化。對于PD,NTRK1由移植的MSCs細胞釋放到附近的神經(jīng)干細胞,能夠促進神經(jīng)干細胞分化為特定的神經(jīng)類型細胞,例如帕金森病模型大鼠的黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元。在本試驗,我們首次選取PB-MSCs,非其他來源的MSCs,作為治療的干細胞,移植入6-OHDA損毀PD大鼠模型,旨在探討PB-MSCs對PD模型大鼠病灶是否有修復作用和免疫調(diào)節(jié)以及NTRK1基因修飾的PB-MSCs能否促進上述效應。研究目的:MSCs治療是PD細胞治療的熱點之一,基因修飾MSCs更是PD治療的新興方向,本實驗探討PB-MSCs對PD模型大鼠病灶是否有修復和免疫調(diào)節(jié)作用以及NTRK1基因修飾的PB-MSCs能否促進上述效應。(1)探討PB-MSCs能否可以作為PD模型大鼠的種植細胞;(2)探討PB-MSCs移植至PD模型大鼠后,PD模型大鼠的行為學改變,以及移植后PD模型大鼠的行為學改善的最佳時期;(3)探討PB-MSCs移植至PD模型大鼠后,在行為學改善最佳的時期,PD模型大鼠腦內(nèi)的DA存活量;(4)探討PB-MSCs移植至PD模型大鼠后,在行為學改善最佳的時期,PD模型大鼠腦內(nèi)的促炎因子表達水平;(5)探討NTRK1基因修飾的PB-MSCs移植至PD模型大鼠后,在行為學改善最佳的時期,PD模型大鼠腦內(nèi)的DA存活量;(6)探討NTRK1基因修飾的PB-MSCs移植至PD模型大鼠后,在行為學改善最佳的時期,PD模型大鼠腦內(nèi)的促炎因子表達水平。實驗動物及方法:我們用體重相近的若干只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠作為實驗動物,借助腦立體定向儀將適量6-OHDA注射入SD大鼠中的黑質(zhì)和前腦內(nèi)側(cè)束來建立PD大鼠模型,1個月后,借助阿撲嗎啡誘導SD大鼠旋轉(zhuǎn),符合行為行為學改變的被評為PD模型成功建立。分離、純化和富集5個健康志愿者的外周血以獲取PB-MSCs,經(jīng)過原代培養(yǎng)和5次傳代培養(yǎng)以獲得更高數(shù)量的PB-MSCs,選用生長狀態(tài)良好的 PB-MSC,用單克隆抗體 CD34-FITC,CD45-PE,CD29-APC,和CD105-PE-Cy7對PB-MSCs的表型進行化學鑒定。構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pUC118-NTRK1,轉(zhuǎn)化并使擴增,鑒定后,構(gòu)建和鑒定pAdenoX-CMV-NTRK11重組腺病毒。以 PB-MSCs作為載體,用pAdenoX-CMV-NTRK1重組腺病毒感染PB-MSCs,使其過表達NTRK1。通過定向腦內(nèi)注射將 PBS、NTRK1、PB-MSCs、NTRK1-PB-MSCs注入PD大鼠的黑質(zhì)和紋狀體;通過旋轉(zhuǎn)試驗在細胞移植后2周、4周、6周、8周對各組PD大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)進行評定,以獲知細胞移植后PD大鼠行為改變的最佳時期;PD大鼠移植PB-MSCs 8周后,灌流固定SD大鼠,獲取腦組織并冰凍切片,通過組織免疫熒光技術(shù)和組織免疫組化技術(shù)評估TH的含量以明確各組間PD模型的多巴胺神經(jīng)元的含量;PD大鼠移植PB-MSCs 2周后,灌流固定SD大鼠,獲取腦組織并通過Elisa測定各組PD模型的促炎因子(TNF-a和IL-1β)的表達水平。所有結(jié)果均以均數(shù)±標準差表示。應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,采用單因素方差分析(ANOVA)進行各組間的差異顯著性檢驗,以P0.05為差異有顯著意義。研究結(jié)果:1、人PB-MSCs的表型鑒定從5名健康供體中分離外周血MSCs,然后在適當?shù)臈l件下進行培養(yǎng),以保持MSCs的生物學特征。CD34,CD45,CD29和CD105是MSCs的標志物。在鋪板后72小時,貼壁細胞顯示出MSCs細胞特有的梭形或多邊形,然后對其進行染色和流式分選。根據(jù)MSCs的表型(如圖1所示:CD34-CD45-CD29+CD105+),我們將貼壁細胞鑒定為MSCs細胞而非造血干細胞。上述數(shù)據(jù)提示我們成功從外周血中分選出MSCs。2、NTRK1在PBMSCs中過表達的情況我們分別把Ad.NTRK1、Ad.null轉(zhuǎn)染入PBMSCs,用RT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡試驗分別檢測各組的NTRK1和NTRK1蛋白表達的情況,結(jié)果如圖2所示。圖2a顯示,Ad.NTRK1組的NRTK1 mRNA明顯高于對照組和Ad.null組的。圖2b顯示Ad.NTRK1組的NTRK1蛋白的表達量是最高的,蛋白定量分析進一步顯示,Ad.NTRKl組的NTRK1蛋白含量是對照組和Ad.null組的4倍(如圖2c)。這些結(jié)果證實,NTRK1成功轉(zhuǎn)染到PBMSCs中,并導致NTRK1蛋白水平升高。3、PD大鼠移植PBMSCs后的行為改變帕金森病模型大鼠體內(nèi)被注射入過表達NTRK1的PBMSCs,然后評估旋轉(zhuǎn)行為學的變化。依據(jù)既往文獻,用6-OHDA建立帕金森病大鼠模型。借助立體定向儀把過表達NTRK1的MSCs移植入SN中。在移植后的2,4,6,8周評估PD模型大鼠的旋轉(zhuǎn)能力。在四組(PBS組、Ad.NTRK1組、PBMSCs組和Ad.NTRK1-PBMSC組),我們發(fā)現(xiàn)過表達NTRK1的Ad.NTRK1-PBMSCs組的PD模型大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少最多,提示旋轉(zhuǎn)能力的改善程度最大,其次是PBMSCs組的(如圖3所示)。與PBS組相比,4周后Ad.NTRK1-PBMSCs組的PD模型大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的減少是有顯著性統(tǒng)計學差異的。然而,與PBS組相比,8周后PBMSCs組的PD模型大鼠的轉(zhuǎn)數(shù)減少才具有顯著性統(tǒng)計學差異。PBS組的轉(zhuǎn)數(shù)與Ad.NTRK1組的相比,二者無明顯統(tǒng)計學差異。值得注意的是,4周后,與PBMSCs組的相比,Ad.NTRK1-PBMSCs組的PD模型大鼠旋轉(zhuǎn)能力的改善更為明顯。這些結(jié)果顯示,PBMSCs可改善PD模型大鼠的行為,而過表達的NTRK1可促進這一效應。4、PD大鼠移植PBMSCs后多巴胺神經(jīng)元的變化帕金森病的主要特征是DA神經(jīng)元的變性。在帕金森病大鼠模型中,注射6-OHDA后導致SN嚴重的DA神經(jīng)元變性(如圖4a所示)。在移植8周后,對SN和紋狀體進行染色,來評估移植的PBMSCs對DA神經(jīng)元產(chǎn)生的影響。SN中TH陽性細胞的定量顯示,PBMSCs組有更多的TH陽性細胞,幾乎是PBS組中的3倍(如圖4b所示)。在PBS組與Ad.NTRK1組之間,TH 陽性細胞數(shù)量無明顯差異。然而,與PB-MSC組相比,Ad.NTRK1-PBMSCs組有更多的TH陽性細胞。紋狀體中的TH免疫反應性纖維也顯示出相同的趨勢(如圖4c,d所示)。這些結(jié)果提示立體腦內(nèi)定向注射PBMSCs能引起SN中TH 陽性細胞明顯增多,然而此種效應在Ad.NTRK1-PBMSCs組中最為明顯,意味著過表達NTRK1能夠促進帕金森病模型大鼠中黑質(zhì)的DA神經(jīng)元的再生。5、PD模型大鼠移植PBMSCs后炎癥因子的變化據(jù)報道指出,MSCs具有體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用的能力。為了驗證PBMSCs是否具有免疫調(diào)節(jié)能力,我檢測所有組別病灶中的促炎因子(TNF-a 和 IL-1β)。在 PBMSCs 組和 Ad.NTRK1-PBMSCs 組之間,上述兩種細胞因子并無明顯差異。然而,TN F-a和IL-1β在轉(zhuǎn)染了 PBMSCs的組別中均有輕度的下降。這些結(jié)果提示,無論NTRK1是否過表達,PBMSCs對體內(nèi)細胞因子的產(chǎn)生均有影響。研究結(jié)論:1、PBMSCs移植入PD大鼠腦內(nèi)后,存活的DA增多,提示其可作為PD模型大鼠的種植細胞。2、PBMSCs移植入PD模型大鼠腦內(nèi)中,病灶內(nèi)存活的DA增多和PD模型大鼠的行為學改變,提示其具有修復DA的作用。3.PBMSCs移植入PD模型大鼠腦內(nèi)中,病灶內(nèi)促炎因子的濃度下降,提示其具有免疫調(diào)節(jié)的作用。4.NTRK1修飾的PBMSCs移植入PD模型大鼠腦內(nèi)后,病灶內(nèi)存活的DA進一步增多,提示NTRK1可促進PB-MSCs的旁分泌效應的作用,可進一步促進DA的修復。5.NTRK1修飾的PBMSCs移植入PD模型大鼠腦內(nèi)后,病灶內(nèi)促炎因子未見進一步下降,提示NTRK1修飾的PBMSCs未能進一步發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)效益。6.PBMSCs也許可作為PD治療的一種新型策略,NTRK1修飾PBMSCs可促進治療PD的效應。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R742.5;R-332
【圖文】：

Ｃｔｒｌ邋Ａｄ．Ｎｕｌｌ邋Ａｄ．ＮＴＲＫＩ邐Ｃｔｒｌ邋Ａｄ．Ｎｕｌｌ邋Ａｄ．ＮＴＲＫＩ逡逑圖２慢病毒介導的ＮＴＲＫ１過表達的鑒定。逡逑ａ．各組間ＮＴＲＫ１邋ｍＲＮＡ的表達水平。ＧＡＰＤＨ為內(nèi)參。逡逑ｂ和ｃ．各組間ＮＴＲＫ１蛋白的表達水平。ＧＡＰＤＨ為內(nèi)參逡逑所有的數(shù)據(jù)均以平均數(shù)士標準差表達。逡逑

圖１邋ＰＢ－ＭＳＣｓ的表型特點

圖３邋ＰＤ大鼠移植ＰＢ－ＭＳＣｓ前后的行為學改變（每組８只ＳＤ大鼠）逡逑所有的數(shù)據(jù)均以平均數(shù)土標準差表達逡逑與空白對照組相比，‘＞＜０．０１，＞＜０．０５逡逑

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