【摘要】：精子是雄性生殖細(xì)胞終末分化細(xì)胞,其染色體為實現(xiàn)精子功能,亦產(chǎn)生了特異的變化。與體細(xì)胞不同,精子染色體主要由DNA纏繞精蛋白組成,精子細(xì)胞核內(nèi)DNA高度壓縮,在哺乳動物的精子中,僅殘留約5%-15%的組蛋白。在精子發(fā)生的過程中,精原細(xì)胞經(jīng)過自身有絲分裂、初級精母細(xì)胞和次級精母細(xì)胞的減數(shù)分裂及精子形成過程實現(xiàn)精子的成熟。伴隨該過程,精子染色體亦發(fā)生劇烈的特征性變化,在減數(shù)分裂階段,染色質(zhì)經(jīng)歷聯(lián)會及兩次減數(shù)分裂的過程,在精子形成過程,染色質(zhì)經(jīng)歷組蛋白過渡蛋白替換、過渡蛋白精蛋白替換的過程,以上過程伴隨著劇烈的表觀遺傳方面的變化。本研究采用高通量測序的方法,嘗試闡釋在小鼠精子發(fā)生過程中組蛋白H2A變體在粗線期初級精母細(xì)胞及圓形精子細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)變化狀態(tài)及其生物學(xué)功能,以及組蛋白修飾H3K79me3在粗線期出現(xiàn)的作用。研究采用STA-PUT的方法,在小鼠睪丸中分離粗線期初級精母細(xì)胞及圓形精子;采用Native-ChIP的方法,對分離細(xì)胞進(jìn)行建庫。經(jīng)高通量測序的數(shù)據(jù),結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫報道的數(shù)據(jù),采用生物信息學(xué)的方法,在基因定位、染色體定位及與轉(zhuǎn)錄水平關(guān)系的方面對組蛋白H2A變體在分離細(xì)胞中的分布進(jìn)行研究;結(jié)合公共數(shù)據(jù),對粗線期初級精母細(xì)胞中組蛋白修飾H3K79me3占位序列與其他修飾、變體間的占位相互關(guān)系及其與轉(zhuǎn)錄的關(guān)系和該修飾占位基因的功能等方面進(jìn)行分析。研究成功構(gòu)建了組蛋白H2A變體H2A.Z、γH2A.X、macroH2A在粗線期及圓形精子階段及H3K79me3在粗線期的Native-ChIP測序文庫。首次以ChIP-seq的方法,即單核小體分辨率水平,描述了研究中涉及的各變體在粗線期和圓形精子細(xì)胞中分布和定位的情況及H3K79me3在粗線期染色體上的分布狀況。研究發(fā)現(xiàn),組蛋白H2A變體在所分離的細(xì)胞階段在基因上的定位極為有限,且大部分分布于基因間隔區(qū)和內(nèi)含子區(qū),組蛋白H2A變體對圓形精子階段性染色體轉(zhuǎn)錄再激活無直接作用,發(fā)現(xiàn)研究中涉及的組蛋白H2A各變體在分離細(xì)胞階段的功能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控?zé)o直接關(guān)系,可能參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織和染色質(zhì)重塑。此外發(fā)現(xiàn),圓形精子階段組蛋白變體間存在較強(qiáng)的共定位現(xiàn)象,提示在該階段組蛋白H2A變體間存在較強(qiáng)的替換。另外,在精子發(fā)生體系中,采用生物信息分析的方法驗證了 H3K4me3與H3K79me3之間存在相互作用的結(jié)論,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)H3K79me3在粗線期的出現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān),特別是與粗線期至圓形精子階段的特異基因的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān),該發(fā)現(xiàn)不同于已有基于免疫熒光染色觀察的發(fā)現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R321.1
【圖文】：

以在基因組范圍以染色質(zhì)角度來理解細(xì)胞特征。目前，己知的表觀遺傳分子機(jī)制包逡逑括ＤＮＡ甲基化、組蛋白修飾及組蛋白變體、染色質(zhì)重塑和ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ等幾個逡逑方面（圖１）。逡逑ＤＮＡ甲基化通常是指５ｍＣ，即胞嘧啶的第５位碳原子被加上了一個甲基，５ｍＣ逡逑在基因表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)座子的沉默和異染色質(zhì)的維持方面有重要作用，其功能主要是逡逑抑制基因的表達(dá)，特別是在啟動區(qū)和轉(zhuǎn)錄起始位點的甲基化，因此５ｍＣ也被稱為逡逑“第五種堿基”。逡逑組蛋白的修飾可以影響核小體間的相互作用，從而進(jìn)一步影響整個染色質(zhì)的結(jié)逡逑構(gòu)。目前認(rèn)為組蛋白的翻譯后修飾主要是用來調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，其具體機(jī)制逡逑包括以下兩種［２，３］：邋—是，組蛋白的翻譯后修飾通過改變組蛋白的電荷狀態(tài)或改變臨逡逑近核小體相互作用狀態(tài)的方式直接調(diào)節(jié)染色質(zhì)的折疊，進(jìn)而調(diào)節(jié)染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)和逡逑ＤＮＡ結(jié)合蛋白可接近性。此外

是一個動態(tài)的生物學(xué)過程，過程中會產(chǎn)生新的核小體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變?nèi)旧|(zhì)的組成逡逑及狀態(tài)。在動物體內(nèi)，Ｈ３，邋Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ及ＨＩ組蛋白變體均有發(fā)現(xiàn)，而Ｈ４是目前逡逑哺乳動物中唯一沒有變體的組蛋白。以小鼠為例，繪制的組蛋白進(jìn)化樹見圖２。目逡逑前，研宄較多的Ｈ２Ａ組蛋白變體有Ｈ２Ａ．Ｘ、Ｈ２Ａ．Ｚ、ｍａｃｒｏＨ２Ａ和Ｈ２Ａ．Ｂ，Ｈ３組逡逑蛋白變體有Ｈ３．３、著絲粒特異變體ＣＥＮＰ－Ａ、睪丸中特異表達(dá)的Ｈ３ｔ和Ｈ３．５及僅逡逑在靈長類細(xì)胞中存在的Ｈ３．Ｘ和Ｈ３．Ｙｍ。逡逑７逡逑

由于其特殊的功能，精子有其特殊的細(xì)胞學(xué)特性和遺傳學(xué)特性。精子染色質(zhì)在逡逑組成上和結(jié)構(gòu)上，與體細(xì)胞相比均有極大的差異。目前，根據(jù)已有的知識，對哺乳逡逑動物精子染色質(zhì)提出的模型如圖３示：大部分精子ＤＮＡ被精蛋白纏繞，形成緊密逡逑的圓環(huán)狀，這是哺＾＾動物細(xì)胞精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)最大特征［８＿１（）］，該比例的ＤＮＡ在人類逡逑精子中約占８５－９５％［１１Ｍ３］。纏繞于每個精蛋白圓環(huán)（ｐｒｏｔａｍｉｎｅｔｏｒｏｉｄ）的ＤＮＡ總長逡逑度約５０ｋｂ，另有證據(jù)表明，每個精蛋白圓環(huán)皆為一個ＤＮＡｌｏｏｐ結(jié)構(gòu)域（ＤＮＡｌｏｏｐ逡逑ｄｏｍａｉｎ）邋［１４］。精蛋白圓環(huán)之間由短的ＤＮＡ相連，被稱為精蛋白ｌｉｎｋｅｒ邋（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ逡逑ｌｉｎｋｅｒ）。這些ｌｉｎｋｅｒ?qū)Γ模危翐p傷劑極為敏感。精蛋白圓環(huán)之間的排列呈堆積的救生逡逑圈狀［１５］，而染色質(zhì)更高級的排布結(jié)構(gòu)仍然未知。剩余的基因組ＤＮＡ則是仍然結(jié)合逡逑在組蛋白上，以核小體的形式保留于精子染色體上［１１，１３］。精子中核小體并非隨機(jī)分逡逑布于整個基因組［１６，１７］，某些發(fā)育早期的基因會以核小體的形式存在于染色體上。根逡逑據(jù)目前研究結(jié)果，人類精子中組蛋白結(jié)合的染色質(zhì)區(qū)域可以分為兩類：一類是ｌ0ｋｂ逡逑或者更大的結(jié)構(gòu)域

本文編號：2744317