【摘要】：背景毛囊是控制毛發(fā)生長的皮膚附屬器官,在哺乳動(dòng)物的整個(gè)生命過程中,毛囊反復(fù)經(jīng)歷著生長期(anagen)、退行期(catagen)和休止期(telogen)的過程,通過循環(huán)周期性的生長,毛囊顯示出了充分的自我再造能力。另外人們發(fā)現(xiàn)不同物種的毛囊其生長周期的長短不同,其節(jié)律也不盡相同。例如,人和豚鼠其不同部位的毛囊生長周期的節(jié)律不同。而大多數(shù)脊椎動(dòng)物的生長節(jié)律則是同步的。那么這個(gè)控制生長周期節(jié)律的生物鐘在什么部位?受哪些因素的調(diào)節(jié)?這些問題目前尚待闡明。一直以來毛囊生長周期的研究熱點(diǎn)是關(guān)于各種生長因子或細(xì)胞因子。很多學(xué)者對比研究這三個(gè)不同周期,比如環(huán)境因素的刺激、細(xì)胞因子表達(dá)的差異和細(xì)胞凋亡情況等,然后提出其可能的調(diào)控作用,這所有的理論研究都還待進(jìn)一步證實(shí)。目前已經(jīng)確定的關(guān)于參與毛囊生長周期調(diào)控的可溶性因子,如毛囊生長期表達(dá)的重要生長因子胰島素樣生長因子；毛囊生長期向退行期轉(zhuǎn)變過程中的轉(zhuǎn)化生長因子；毛囊休止期向生長期轉(zhuǎn)化過程中的骨形成蛋白等。但這些因子的作用機(jī)制有的還不是非常清楚。另外,關(guān)于毳毛向硬毛的轉(zhuǎn)化機(jī)制、部分毛囊退出毛囊生長周期、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞在生長周期中的作用、中樞神經(jīng)系統(tǒng)對毛囊生長周期的調(diào)控和毛囊對皮膚生物學(xué)的影響等方面,有關(guān)學(xué)者也進(jìn)行了大量的研究并得到了一定的進(jìn)展。毛囊的生長和發(fā)生是非常復(fù)雜的多因素相互調(diào)控和相互影響的過程,毛囊的發(fā)育成熟,需要間質(zhì)細(xì)胞與上皮間的基質(zhì)成分產(chǎn)生一系列的信號傳遞,來促進(jìn)細(xì)胞之間的相互作用才能完成。在毛囊周期循環(huán)的過程中,一些細(xì)胞因子、活性蛋白、酶類、激素等均可對毛囊周期的生長產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用,而這些物質(zhì)均存在于細(xì)胞外基質(zhì)中。各種細(xì)胞依賴于細(xì)胞外基質(zhì)才能構(gòu)筑基本結(jié)構(gòu)。所以ECM中含有的各種成分對細(xì)胞的生長和增殖都有著非常關(guān)鍵的作用�；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallproteinases,MMps)是一類由許多結(jié)構(gòu)和功能相近似的中性蛋白酶所組成的多基因、內(nèi)源性的Zn依賴性酶家族。它是由單核細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生,可以降解除了多糖以外的所有細(xì)胞外基質(zhì)成分�；|(zhì)金屬蛋白酶的降解功能可以導(dǎo)致相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)重塑,尤其是能夠分隔毛囊的上皮層(如外根鞘等)和間質(zhì)層(如真皮鞘和真皮乳頭等)的基底膜,這對于正常毛囊的生長和發(fā)育是必要條件�；啄さ闹厮�,對于毛囊生長周期內(nèi)上皮與間質(zhì)成分間的信號傳輸以及生長期下段時(shí)毛囊延伸并侵犯皮下組織是必不可少的�；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(Tissue inbitors metalloproteinases,TIMPs)是MMps的內(nèi)源性特異性抑制物。TIMPs家族里共有四個(gè)成員,分別為TIMP-1、TIMP-2、 TIMP-3和TIMP-4。在正常的生理過程中,比如生長發(fā)育、組織修復(fù)等,均涉及到對ECM的降解和準(zhǔn)確定位,這就是ECM的重塑過程。在此過程中,可能會(huì)引起疾病,如癌癥、關(guān)節(jié)炎和心血管疾病,雖然是一種修復(fù)性的行為,但往往是特異且破壞性的表達(dá)。目前已知的各種類型的蛋白水解酶中,最主要的酶系就是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)。研究表明,MMPs在調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的生物活性分子方面和調(diào)節(jié)細(xì)胞環(huán)境方面都有重要作用,并最終影響到細(xì)胞的行為方式。有著特定功能的酶在正�；虿±頎顟B(tài)下也會(huì)有不同的功能表現(xiàn),在明確MMP的作用方面,抑制劑是目前主要的研究方向。本研究通過對MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2在毛發(fā)周期過程中動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律及作用機(jī)制進(jìn)行深入探索。研究中以3周到12周的C57BL/6雌鼠的毛發(fā)生長周期為標(biāo)準(zhǔn),通過系統(tǒng)性地檢測并結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn),來分析基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑對毛發(fā)周期的作用規(guī)律和影響,并初步探索了其中的作用機(jī)制,為理解細(xì)胞外基質(zhì)消解變化的原因及其對毛發(fā)周期的作用提供了新的研究策略。該研究結(jié)果對闡明毛囊生長周期調(diào)控機(jī)制、研究毛囊生物學(xué)、毛發(fā)形成及重建并最終發(fā)展有效治療脫發(fā)的手段具有重要意義。目的1.探尋毛發(fā)周期內(nèi)MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律2.尋找基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑SB-3CT對毛發(fā)生長的影響3.探索抑制劑影響毛發(fā)生長過程中可能的機(jī)制方法1.毛發(fā)周期中MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2動(dòng)態(tài)分析1.1明膠酶譜取3周到12周C57BL/6雌性小鼠各個(gè)周期50mmg小鼠皮膚組織,加500ul的裂解液進(jìn)行研磨組織,制備10%勻漿溶液,14000rpm 4℃離心10min,取上清。取100ul與25ul 5×上樣緩沖液混合。配制分離膠和濃縮膠,5u1/孔上樣(根據(jù)表達(dá)強(qiáng)度和蛋白濃度確定上樣量),4℃進(jìn)行SDS-PAGE電泳100v約1.5小時(shí)(電泳時(shí)在周圍敷上冰,有利于使條帶跑直)。電泳結(jié)束后,將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫2次,每次40分鐘,然后用漂洗液漂洗2次,每次20分鐘,接著,將凝膠置于孵育液中37℃孵育42h。孵育結(jié)束后經(jīng)染色液(0.05% Coomassic亮藍(lán)、30%甲醇、10%乙酸)染色3h,及脫色液3h,顯示出MMP-2(72KD)和MMP-9(92KD)為位于藍(lán)色背景上的透亮帶。1.2免疫組化1.2.1常規(guī)HE：取各個(gè)周期的組織標(biāo)本用福爾馬林固定液固定6h以上后脫水包埋,再進(jìn)行常規(guī)組織切片、烤片,最后進(jìn)行染色和中性樹膠封片。1.2.2免疫組化：將石蠟切片進(jìn)行烤片、脫蠟至水后,再用蒸餾水洗3min,檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)3 min,自然冷卻至室溫,接著用3% H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶室溫下孵育10min, PBS液沖洗后,分別將Anti-TIMP1、Anti-TIMP2、 Anti-MMP、Anti-MMP2用抗體稀釋液以1：200稀釋后,滴加抗體于組織切片上,最后滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體37℃孵育30 min,滴加DAB顯色液后,蘇木素復(fù)染,0.1%HCl分化,自來水沖洗,藍(lán)化,切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封固,晾干后觀察。1.2.3 ELISA:將試劑盒以及樣品平衡至室溫(18-25℃),再將所有標(biāo)準(zhǔn)品以及樣品使用單孔檢測,在已經(jīng)包被抗體的ELISA板對應(yīng)的孔內(nèi)加入100 μL配制好的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品,用封板膜封住整塊板條,4℃孵育過夜；將配制好的1x洗液添加到洗板機(jī)上,用洗板機(jī)清洗板條4次,每孔加入300μL洗液,每孔加入100μL配制好的檢測抗體(生物素標(biāo)記抗體),室溫孵育1h,清洗后每孔加入100μL配制好的HRP-鏈霉親和素室溫孵育45 min,再次清洗后加入100μL TMB顯色液至每孔中,室溫避光孵育30min,最后加入50μL終止液至每孔中,立即在酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)。1.2.4 qRT-PCR:用液氮研磨組織至粉末后進(jìn)行總RNA抽提、去基因組后,進(jìn)行總RNA純度和完整性檢測,證明總RNA抽提比較完整后再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在進(jìn)行定量PCR檢測前先進(jìn)行引物測試,確定好上機(jī)內(nèi)容后編排好上機(jī)的樣品排放順序,然后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn),將實(shí)驗(yàn)中計(jì)算好的體系按具體量配置,總的體系配好后裝至八連管中,最后使用定量PCR儀,每個(gè)樣重復(fù)3次,得到最后的結(jié)果。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)首先將8周的C57BL/6雌性小鼠背部的毛發(fā)剪短,然后用棉球蘸取脫毛膏,在所需部位(約8cm2)脫毛,將脫毛后的小鼠背部分別涂用不同濃度的SB-3CT基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑,一天2次,一個(gè)星期5天,共30天。實(shí)驗(yàn)周期的30天內(nèi),拍攝老鼠背部照片,一天一次。通過觀察圖像評估小鼠毛發(fā)再生,計(jì)算毛發(fā)再生比率。定期安樂死小鼠后再切取每只小鼠的背部皮膚,對小鼠皮膚進(jìn)行HE染色,通過Image J軟件進(jìn)行圖像分析,計(jì)算不同時(shí)期毛囊數(shù)量及毛囊長度,同時(shí)進(jìn)行相關(guān)免疫組化、ELISA及HE染色,最后將所得到的數(shù)據(jù)、圖片資料匯總整理。3.研究VEGF-IGF-1-TGF-β信號通路在毛發(fā)再生中的作用及與MMP的關(guān)系3.1定量PCR檢測3.1.1皮膚組織總RNA的提取先在研缽中加入液氮,再將組織剪成小塊在液氮中磨成粉末,用液氮預(yù)冷的藥匙取50～100mg組織粉末加入已盛有l(wèi)ml的Trizol液的EP管中(注意組織粉末總體積不能超過所用Trizol體積的10%),充分混合均勻。室溫放置5min,然后加入200u1的氯仿,蓋緊EP管并劇烈搖蕩15秒鐘。12000rpm離心10min,取上層水相于一新的EP管中(千萬不要將中間的沉淀層和下層液混入,否則重新離心分離),加入500u1異丙醇,溫和顛倒混勻。室溫放置10min,12000rpm離心10min。小心地棄去上清液,加入1ml的75%乙醇,渦旋混勻,4℃下12000rpm離心5min。重復(fù)操作一次。棄去上清液(盡量將殘余液體除去),室溫或真空干燥5～10min(注意不要干燥過分,否則會(huì)降低RNA的溶解度)。用30ulDEPC處理過的水將RNA溶解,必要時(shí)可55℃-60℃水浴10min。RNA可進(jìn)行mRNA分離,或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。3.1.2 RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)以1μg總RNA為模板,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,37℃,60min; 98℃,10min,合成cDNA第一鏈。已cDNA鏈為模板進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。3.2:ELISA3.2.1總蛋白的提取取40 mg固體組織剪碎后加入0.5ml裂解液(提前按比例加入PMSF, cocktail,磷酸酶抑制劑等),放入玻璃勻漿器內(nèi)上下手動(dòng)勻漿破碎組織。待樣品盡量全部磨碎后,將蛋白溶液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中。冰上充分裂解30 min。4℃離心機(jī)14000 rpm離心10 min后取上清即為總蛋白溶液。3.2.2 ELISA檢測分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本100ul,輕輕晃動(dòng)混勻,覆上板貼,37℃溫育1.5小時(shí)。棄去液體,洗滌5次。每孔加生物素化抗體工作液100u1,覆上新的板貼,37℃溫育1小時(shí)。棄去孔內(nèi)液體,洗板5次,甩干。每孔加酶結(jié)合物工作液100u1,覆上新的板貼,37℃溫育30分鐘。棄去孔內(nèi)液體,洗板5次,甩干。每孔加入顯色底物溶液(TMB) 100ul,37℃避光顯色15分鐘。每孔加終止溶液100u1,終止反應(yīng)。在反應(yīng)終止后5分鐘之內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±S)。多組計(jì)量資料采用方差分析比較,方差齊采用One-Way ANOVA,兩兩比較用LSD分析,方差不齊則應(yīng)用welch,兩兩比較用Dunnett's T3分析,同一時(shí)間點(diǎn)兩組的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.在3周到12周的C57BL/6雌性小鼠的背部毛發(fā)周期中,MMP-2、MMP-9的酶活性在每個(gè)周期都存在。對于MMP-2、MMP-9,酶活性在毛發(fā)周期內(nèi)始終處于波動(dòng)狀態(tài)。在毛發(fā)周期的第1個(gè)生長期內(nèi),MMP-2的酶活性出現(xiàn)先下降后上升的趨勢,并且達(dá)到了酶活性的最低值；而第2個(gè)較長的靜止期內(nèi),酶活性出現(xiàn)先上升后下降的狀態(tài),并且達(dá)到了酶活性的最高值。而且,在第一個(gè)生長期過渡到退行期時(shí),MMP-2、MMP-9的酶活性逐漸上升,退行期過渡到靜止期時(shí),MMP-2、MMP-9的酶活性逐漸下降,靜止期過渡到生長期時(shí)則快速下降。對照MMP-9的酶活性曲線,我們得出了類似的結(jié)論。并且通過HE染色我們獲得了典型的組織圖像。MMP-2, MMP-9的酶活性表達(dá)的波動(dòng),與qRT-PCR和ELISA測定的mRNA和蛋白波動(dòng)水平相類似。證明了基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2, MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)在毛發(fā)周期中是相似的和可檢測的。他們的水平在5和7周時(shí)處于最低值,在毛發(fā)周期第10周處于最高值。下一步我們檢測是否TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)是不同于他們對應(yīng)的激活劑MMP-9, MMP-2。最終我們發(fā)現(xiàn),TIMPs的mRNA和蛋白水平波動(dòng)狀態(tài)在對應(yīng)的第5、7周時(shí)處于最高值,第10周處于最低值。毛發(fā)周期內(nèi)波動(dòng)變化的趨勢與MMPs相反。所有這些表明了,TIMPs與MMPs是互為激動(dòng)劑與抑制劑的關(guān)系。在毛發(fā)周期的每個(gè)階段,為了確定MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2的表達(dá)部位,我們通過免疫組化的圖像來顯示。對于MMP-2、MMP-9、TIMP-1在毛囊處表達(dá)為陰性或弱陽性,TIMP-2在毛囊處表達(dá)為強(qiáng)陽性。在皮膚層中,皮脂腺、皮下組織層均可見MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2有表達(dá)。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,SB-3CT這種高效選擇性明膠酶抑制劑作用于剃毛后小鼠背部皮膚后,與空白對照組相比較,實(shí)驗(yàn)組的小鼠毛發(fā)生長速度整體較慢,單位面積毛發(fā)的長度和數(shù)量整體也較空白組低。通過HE染色的典型圖像也證明了這一點(diǎn)。免疫組化染色顯示MMP-2、MMP-9在毛囊部位表達(dá)為陰性或弱陽性,再次證明了前面實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。3.將剃毛后的小鼠背部皮膚取材,將SB-3C實(shí)驗(yàn)組和空白組分別進(jìn)行VEGF、IGF-1、TGF-β的mRNA和蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn),在毛發(fā)周期內(nèi)生長期、退行期和靜止期各個(gè)階段,VEGF、IGF-1的實(shí)驗(yàn)組值較空白對照組明顯下降,而TGF-β的實(shí)驗(yàn)組值較空白對照組逐漸上升。結(jié)論1.本研究通過MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2在小鼠毛發(fā)周期的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,說明由于由于生長期需要大量的基質(zhì)金屬蛋白酶來消化細(xì)胞外基質(zhì)以釋放其中的關(guān)鍵細(xì)胞因子或激素,所以需要較長時(shí)間的靜止期才能積累足夠量的基質(zhì)金屬蛋白酶,并在生長期的早期出現(xiàn)明顯的下降,故基質(zhì)金屬蛋白酶對毛囊器官的周期性生長可能起到關(guān)鍵作用。提示我們MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2參與毛乳頭細(xì)胞外基質(zhì)的重塑,并且這種重塑又與毛囊生長周期密切相關(guān)。免疫組化的結(jié)果說明基質(zhì)金屬蛋白酶在毛囊器官或周圍的附屬器官都存在,并不是只表達(dá)在單一的組織器官內(nèi)。2.基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑對毛發(fā)生長有抑制作用,從另一方面也證實(shí)毛發(fā)周期性生長與MMP-2, MMP-9有關(guān),并且可能通過影響VEGF、IGF-1、TGF-β的通路來影響的毛發(fā)生長。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R33
【圖文】：

４．實(shí)驗(yàn)組與空白組再生毛發(fā)比率的對比逡逑下圖顯示出實(shí)驗(yàn)組在整個(gè)毛發(fā)再生過程中，毛發(fā)生長速率較空白組快，提逡逑示基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑對毛發(fā)再生有抑制作用（表２－１，圖２－７）逡逑表２－１毛發(fā)再生的比率逡逑

５．實(shí)驗(yàn)組與空白組再生毛發(fā)長度的對比逡逑下圖思示出實(shí)驗(yàn)組在整個(gè)毛發(fā)再生過程中，毛囊再生的長度較空白組短，逡逑提示基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑對毛發(fā)再生有抑制作用（表２－２，圖２－８）逡逑表２－２再生毛發(fā)的長度逡逑剎毛后天數(shù)邐ｃｏｎｔｒｏｌ邐ＳＢ－３ＣＴ邐合計(jì)邐Ｆ值邐Ｐ值逡逑１０邐０．７５±０．０７邐０．３０±０．０７邐０．５３±０．０７逡逑１５邐１．４５±０．０７邐０．５３±０．００邐０．９９±０．０４逡逑１８邐１．６５±０．２１邐１．１６±０．２１邐１．４１邋±０．２１逡逑２０邐１．３０．０．１４邐，３７．０．３４邐１．３３．０．２９逡逑２２邐０．％±０．０７邐０．８０±０．００邐０．８８±０．０４逡逑２５邐０．８５±０．２１邐０．４０±０．１４邐０．的邋±０．１８逡逑２８邐０．５化０．１４邐０．２０±0．0７邐０．３５±０．１１逡逑合計(jì)邐１．０６±０．１３邐０．６８±０．１２邐０．８７±０．１３邐逡逑Ｆ邋值邐６０．４８４邐Ｆ＝４．６３４逡逑Ｐ邋值邐＜０．００１邐Ｐ＝０．００２邐逡逑弟掩后天數(shù)與組別之間存在著交互效應(yīng)Ｆ＝４．６３４，Ｐ＝０．００２．逡逑４４逡逑

本文編號：2740071