【摘要】：目的:探究粉塵螨Ш類變應(yīng)原Der f 3的免疫治療效果及其表位疫苗。方法:1.隨機(jī)將40只BALB/c小鼠分為4組,PBS組(陰性對(duì)照組)、OVA組(陽(yáng)性對(duì)照組)、Der f 3變應(yīng)原致敏組(哮喘組)、Der f 3變應(yīng)原免疫治療組(SIT組)。哮喘組和SIT組小鼠用粉塵螨粗提液分別于0、7、14 d進(jìn)行腹腔注射致敏,第21 d滴鼻激發(fā),連續(xù)7 d,其中免疫治療組小鼠在第25~27 d滴鼻激發(fā)之前30 min用Der f3蛋白皮下注射進(jìn)行特異性免疫治療。PBS組和OVA組分別用PBS和OVA進(jìn)行腹腔注射和滴鼻激發(fā)。最后一次滴鼻激發(fā)24 h后脫臼處死。收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù);ELISA檢測(cè)BALF和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液(SSCS)中細(xì)胞因子IL-5、IFN-γ及血清中變應(yīng)原特異性IgE、IgG2a抗體水平;肺組織進(jìn)行HE染色。2.運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)Der f 3的T細(xì)胞抗原表位并人工合成所預(yù)測(cè)的T細(xì)胞表位肽;采用改良MTT法,用預(yù)測(cè)表位肽刺激致敏小鼠脾淋巴進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-5水平。3.運(yùn)用生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)Der f 3的B細(xì)胞線性抗原表位;人工合成所預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位肽并固定于硝酸纖維素膜上,將該膜分別與由12份螨性過(guò)敏哮喘患者血清組成的3個(gè)血清池孵育,再經(jīng)抗人IgE-HRP二抗結(jié)合、DAB顯色后,分析陽(yáng)性點(diǎn)。4.構(gòu)建包含表達(dá)含有Der f 3 T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位(在本實(shí)驗(yàn)室前期免疫試驗(yàn)中被證實(shí)所得的T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位)的載體基因并表達(dá)出該蛋白并命名為Der f 3-peptides,我們用該蛋白與特異性T細(xì)胞株(來(lái)自Der f 3皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽(yáng)性患者的外周血單核細(xì)胞)共培養(yǎng)進(jìn)行了T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),測(cè)定上清中的細(xì)胞因子水平,并對(duì)比了Der f 3和Der f 3-peptides與特異性抗體Ig E結(jié)合的能力。結(jié)果:1.與哮喘組相比,SIT組小鼠肺部炎癥明顯減輕,BALF中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)顯著低于哮喘組(p0.01)。ELISA法檢測(cè)各組小鼠SSCS及BALF中的IL-5和IFN-γ水平;結(jié)果表明SIT組的BALF和SSCS中IL-5的水平明顯低于OVA組和哮喘組(p0.01),而IFN-γ含量則顯著升高(p0.01);與OVA組和哮喘組相比,SIT組血清中的變應(yīng)原特異性抗體Ig E濃度明顯降低(p0.01),而IgG2a濃度則顯著升高(p0.01)。2.成功預(yù)測(cè)了Der f 3中的5個(gè)T細(xì)胞表位肽,通過(guò)脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn),其中3個(gè)表位肽序列可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖并刺激細(xì)胞因子IL?2和IFN?γ的分泌,抑制細(xì)胞因子IL?4和IL?5的分泌。其序列分別是37DCPYQISLQSSSHFCGG54、98IYQHENYDSMTIDNDVALIKLKTPMT123和164SELQRVDIDVVS REQCDQLYS184。3.成功預(yù)測(cè)了Der f 3中的8個(gè)B細(xì)胞表位肽,與過(guò)敏性血清中變應(yīng)原特異性IgE結(jié)合試驗(yàn)獲得5個(gè)強(qiáng)陽(yáng)性表位肽序列。其對(duì)應(yīng)的序列分別為33KAKAGDCP40、86HASGGEKIQVAEIYQHENYDSMTID110、118LKTPMTLDQTNAKPVPLPPQGSDVKVG144、156QEGSYSLP163及199DVANGGVDSCQGDSGGPVVD218。4.Der f 3-peptides可以引起特異性T細(xì)胞增殖,同時(shí)細(xì)胞因子IL-2/IFN-γ水平有上升趨勢(shì)而細(xì)胞因子IL-4/5水平較低,結(jié)果表明Der f 3-peptides與Der f 3蛋白對(duì)特異性T細(xì)胞的刺激增殖能力相似甚至更強(qiáng);Der f 3-peptides與Der f 3相比,其與抗體IgE的結(jié)合力明顯降低。結(jié)論:粉塵螨Ш類變應(yīng)原可有效地進(jìn)行SIT,成功鑒定了Der f 3變應(yīng)原中3個(gè)T細(xì)胞表位序列和5個(gè)B細(xì)胞表位序列并成功構(gòu)建含有T、B細(xì)胞表位的小分子低毒過(guò)敏原,為診斷和治療過(guò)敏性哮喘奠定一定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392

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2 夏立照;李家泉;陳樹仁;;粉塵螨抗元制備[J];安徽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1983年03期

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本文編號(hào)：2736789