【摘要】：目的:早期負性經(jīng)歷(early life adversity,ELA)可以引起成人的壓力相關性行為表現(xiàn)以及對應激性損傷的易感性增加,可能與創(chuàng)傷后應激障礙(post traumatic stress disorder,PTSD)的發(fā)病機制有關。PTSD是指遭遇或目睹涉及自身或他人危及生命的應激性事件或處境所導致的個體延遲出現(xiàn)和持續(xù)存在的精神障礙。其中參與控制應激反應的下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitaryadrenal axis,HPA axis)功能失調(diào)是PTSD發(fā)病的重要特征,血液循環(huán)中的糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)通過作用于糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)參與HPA軸的負反饋調(diào)節(jié),同時有研究報道ELA可導致HPA軸的程序化改變,所以成年后壓力敏感性增強可能是由于持續(xù)的HPA軸活動改變以及GR的表達異常。富含糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)的杏仁核(amygdala)和海馬(hippocampus)在HPA軸調(diào)節(jié)中起關鍵作用。其中杏仁核是調(diào)節(jié)條件性恐懼獲得、表達和消退的關鍵核團,而海馬作為應激反應的整合部位,是調(diào)節(jié)情緒反應和認知行為功能的重要腦區(qū),對動物的學習記憶有著基本的作用,同時具有高度的突觸可塑性。胚胎期和出生早期各種環(huán)境因素的改變均可影響海馬和杏仁核突觸結(jié)構(gòu)的構(gòu)建與功能的完善,進而導致出生后腦功能受損。突觸前膜的突觸素I(synapsin I)對神經(jīng)遞質(zhì)的釋放起調(diào)節(jié)作用,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元之間突觸聯(lián)系的形成和維持。突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density proteins-95,PSD-95)在突觸結(jié)構(gòu)、功能和可塑性等方面發(fā)揮重要作用。除synapsin I和PSD-95以外,定位于突觸的細胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)在影響突觸形成的同時,也可以通過與其他突觸蛋白之間的相互作用,參與信號級聯(lián)反應調(diào)節(jié)突觸之間的信號傳遞,影響突觸功能。如neurexin I和neuroligin-1/-2可以通過影響大腦中興奮性和抑制性神經(jīng)傳遞之間的平衡,改變海馬和杏仁核神經(jīng)元長期的記憶儲存和恐懼調(diào)節(jié),進而導致認知功能障礙。因此我們提出“新生隔離”(neonatal isolation,NI)這種短期重復隔離模式作為早期的心理應激源,是否會通過GR受體引起單一連續(xù)應激(single prolonged stress,SPS)方法構(gòu)建的成年PTSD模型大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元突觸穩(wěn)態(tài)的改變,影響興奮性/抑制性突觸的比例以及興奮和抑制電流平衡,進而導致腦神經(jīng)網(wǎng)絡連接的異常,影響成年后的情感、認知及學習記憶能力,構(gòu)成PTSD的易感性因素。本研究通過三種行為學實驗,曠場實驗(open field test,OF),高架十字迷宮(elevated plus maze test,EPM)及Morris水迷宮(morris water maz,MWM)檢測NI-SPS大鼠的自發(fā)性探索行為、焦慮程度和空間學習記憶能力。從形態(tài)學,蛋白水平,基因水平來探索GR及synapsin I、PSD-95、neurexin I、neuroligin-1/-2在NI和SPS大鼠海馬、杏仁核的表達變化。結(jié)合NI-SPS大鼠的行為學測定,研究ELA是否可以通過GR調(diào)控PTSD大鼠的神經(jīng)可塑性,參與大鼠應激反應、記憶與情感障礙的病理生理過程,為深入揭示PTSD的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。研究方法:1、動物模型制作、實驗分組及生理指標測量:采用的雌性Wistar孕鼠,自由攝食飲水飼養(yǎng)至生產(chǎn),分娩的當天被指定為出生后第0天(postnatal day 0,PND 0)。本研究中共采用了100只雄性幼鼠,隨機分為4組(25只/組):1)對照組:不受任何干擾;2)NI組:僅在PND 2~9接受NI處理,而不接受SPS刺激;3)SPS組:不接受NI處理,僅在PND 56給予SPS刺激;4)NI+SPS組:先在PND 2~9接受NI處理,然后在PND 56接受SPS刺激。幼鼠在PND 22斷奶,在特定的時間點(PND 22,PND 40和PND 60)測量大鼠體重,從PND 63開始,對大鼠進行行為學測試和取材。2、行為學測定:通過行為學實驗OF、EPM及MWM檢測各組大鼠自發(fā)性探索行為、焦慮程度和空間學習記憶能力。3、免疫組織化學:應用免疫組織化學方法,從形態(tài)學角度觀察各組大鼠海馬和杏仁核GR、synapsin I、PSD-95免疫反應性變化。4、酶聯(lián)免疫吸附測定:用ELISA試劑盒測定各組大鼠應激和焦慮時血漿皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT)水平。5、Western blotting:應用Western blotting方法檢測各組大鼠海馬和杏仁核部位GR、synapsin I、PSD-95、neurexin I、neuroligin-1/-2蛋白表達變化。6、Real-Time PCR:應用Real-Time PCR方法檢測各組大鼠海馬和杏仁核synapsin I、PSD-95、neurexin I、neuroligin-1/-2 mRNA的表達變化;7、免疫熒光技術:應用免疫熒光技術檢測海馬neuroligin-1/-2的表達變化。結(jié)果:1、大鼠生理指標的測量:與對照組相比,NI和SPS大鼠攝食和飲水等情況無明顯變化,NI或SPS對大鼠的體重增長情況均無顯著影響。2、行為學檢測結(jié)果:OF實驗中,無論是NI還是SPS對大鼠總體水平運動的影響均不顯著,但是NI+SPS組大鼠進入中心區(qū)域的次數(shù)和運動距離百分比均顯著低于NI組和SPS組;EPM實驗中,SPS組大鼠的開放臂進入次數(shù)百分比和時間百分比顯著低于對照組和NI組,而且NI+SPS組大鼠顯著低于SPS組;MWM實驗中,NI和SPS對大鼠總的運動距離影響也不顯著,但是NI和SPS對大鼠經(jīng)過目標位置次數(shù)和目標象限游泳距離百分比的影響是顯著的,而且NI+SPS組顯著高于SPS組。3、免疫組織化學檢測結(jié)果:大鼠海馬和杏仁核GR的免疫反應定位于神經(jīng)元的細胞核和細胞漿。實驗組大鼠海馬GR的陽性表達較對照組均增強,但是杏仁核GR的陽性表達較對照組均減弱;Synapsin I在對照組大鼠海馬和杏仁核顯示的陽性反應相對淡染,主要分布在神經(jīng)元的細胞膜和細胞質(zhì)。NI處理后,海馬和杏仁核的synapsin I免疫反應增強。SPS組大鼠海馬synapsin I陽性表達增強,而杏仁核的陽性表達較對照組減弱;PSD-95抗體陽性細胞的免疫組化染色為棕色,免疫反應主要見于海馬和杏仁核神經(jīng)元的胞漿和突起。NI組大鼠海馬和杏仁核的PSD-95陽性表達較對照組增強。同時SPS組海馬PSD-95的陽性表達也增強,而杏仁核的陽性表達減弱。4、酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果:對照組和NI組大鼠血漿的基礎CORT水平?jīng)]有顯著差異,而SPS導致大鼠血漿CORT水平顯著升高。另外,NI+SPS組大鼠血漿CORT水平顯著高于對照組和NI組大鼠。5、Western blotting檢測結(jié)果:NI組和SPS組大鼠海馬GR蛋白表達顯著高于對照組,而杏仁核GR蛋白表達顯著低于對照組,NI+SPS組同SPS組相比,海馬和杏仁核GR蛋白表達的改變顯著增強;Synapsin I和neurexin I蛋白在NI組和NI+SPS組大鼠海馬的表達顯著低于對照組,但是在SPS組的表達顯著增高。而NI組和SPS組杏仁核synapsin I和neurexin I的蛋白表達顯著低于對照組,而且NI+SPS組顯著低于SPS組;同對照組相比,NI組和SPS組大鼠海馬PSD-95的蛋白表達和neuroligin-1/-2蛋白表達的比值顯著增高,而且NI+SPS組顯著高于SPS組。NI組大鼠杏仁核PSD-95的蛋白表達與對照組相比顯著升高,而SPS組顯著降低。但是NI組和SPS組大鼠杏仁核neuroligin-1/-2的蛋白表達比例均顯著低于對照組,而且NI+SPS組顯著低于SPS組。7、Real Time PCR檢測結(jié)果:SPS刺激后大鼠海馬synapsin I mRNA的表達同對照組相比顯著上調(diào),但是在NI組和NI+SPS組的表達顯著下降。NI和SPS刺激后杏仁核synapsin I mRNA的表達較對照組均顯著減少;同對照組相比,實驗組大鼠海馬PSD-95 mRNA的表達均顯著增高。NI組杏仁核PSD-95 mRNA的表達較對照組顯著升高,而SPS組顯著降低;經(jīng)過NI和SPS刺激后,大鼠海馬和杏仁核neurexin I mRNA與對照組相比均顯著減少,海馬neuroligin-1/-2 mRNA表達的比值均顯著高于對照組,而杏仁核均顯著低于對照組。7、免疫熒光技術檢測結(jié)果:對照組neuroligin-1和-2在海馬腦區(qū)部分細胞中高表達,不僅在細胞質(zhì)中共同定位,而且在突起中也共同定位,但是軸突染色較少。NI組大鼠海馬腦區(qū)大部分細胞呈極低的neuroligin-1和-2免疫反應,神經(jīng)突起中未表達。而在SPS組大鼠海馬中大多數(shù)細胞共同表達neuroligin-1-和-2,在許多較長的細胞突起中共同定位。在NI+SPS組大鼠海馬中大多數(shù)共同表達的neuroligin-1和-2在較低水平,在細胞突起中共定位,但是在神經(jīng)纖維的數(shù)目少于SPS組。結(jié)論:1、與對照組相比,NI組大鼠在焦慮方面沒有表現(xiàn)出顯著的變化,但是與SPS組大鼠相比,NI+SPS組大鼠在OF和EPM試驗中表現(xiàn)出更高的焦慮水平,說明經(jīng)歷過早期應激的大鼠在成年期可能更容易受到負性經(jīng)歷的影響。2、早期NI并不影響成年大鼠血漿CORT水平,然而SPS組和NI+SPS組大鼠血漿CORT水平增加,那么GR就成為早期應激動物模型中HPA軸功能的關鍵調(diào)節(jié)因子。3、NI組和SPS組大鼠海馬GR的表達水平顯著增高,杏仁核GR表達的改變與海馬完全相反,而且NI增加了海馬和杏仁核這些改變。4、同時NI加重了SPS成年大鼠海馬突觸后膜和杏仁核突觸前膜神經(jīng)元件的變化,并且增加了海馬和杏仁核興奮性和抑制性突觸比例的改變。綜上所述,早期應激引起大鼠的海馬和杏仁核HPA軸功能和突觸可塑性改變可能會持續(xù)至機體成年,進而加重了SPS大鼠遭受創(chuàng)傷時中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變化,增加PTSD的易感性。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R749.5;R-332
【圖文】：

中國醫(yī)科大學博士學位論文2.2.1 實驗動物分組將 100 只雄性幼鼠隨機分為 4 組（25 只/組）：1) 對照組：不受任何干擾；2) NI 組：僅在 PND 2~9 接受 NI 處理，而不接受 SPS 刺激；3) SPS 組：不接受NI 處理，僅在 PND 56 給予 SPS 刺激；4) NI+SPS 組：先在 PND 2~9 接受 NI 處理，然后在 PND 56 接受 SPS 刺激。幼鼠在 PND 22 斷奶，在特定的時間點測量大鼠體重，從 PND 63 開始，對大鼠進行行為學測試和取材。圖 1 顯示了動物的處理步驟。

曠場實驗結(jié)果，各組大鼠的運動軌跡圖。注：A：對照組，B：NI 組，C：SPS 組，D：NI+SPS 組。表 2 NI 和 SPS 對成年大鼠自主運動與探究行為的影響曠場實驗中各組大鼠總的運動距離，進入中心區(qū)域的次數(shù)和中心區(qū)域運動比較。每組包括 15 只雄性大鼠，數(shù)據(jù)表示為均值±SEM。*P<0.001，與性差異；#P<0.001，與 SPS 組比較有顯著性差異；&P < 0.001，與 NI 組。架十字迷宮結(jié)果

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 陳偉恒;陶長路;時美玉;張繼川;徐程;劉北明;畢國強;;突觸可塑性與腦疾病的神經(jīng)發(fā)育基礎[J];生命科學;2014年06期

2 安獻麗;鄭希耕;;創(chuàng)傷后應激障礙的動物模型及其神經(jīng)生物學機制[J];心理科學進展;2008年03期

本文編號：2731352