【摘要】：目的:早期負(fù)性經(jīng)歷(early life adversity,ELA)可以引起成人的壓力相關(guān)性行為表現(xiàn)以及對(duì)應(yīng)激性損傷的易感性增加,可能與創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post traumatic stress disorder,PTSD)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。PTSD是指遭遇或目睹涉及自身或他人危及生命的應(yīng)激性事件或處境所導(dǎo)致的個(gè)體延遲出現(xiàn)和持續(xù)存在的精神障礙。其中參與控制應(yīng)激反應(yīng)的下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitaryadrenal axis,HPA axis)功能失調(diào)是PTSD發(fā)病的重要特征,血液循環(huán)中的糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)通過(guò)作用于糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)參與HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié),同時(shí)有研究報(bào)道ELA可導(dǎo)致HPA軸的程序化改變,所以成年后壓力敏感性增強(qiáng)可能是由于持續(xù)的HPA軸活動(dòng)改變以及GR的表達(dá)異常。富含糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)的杏仁核(amygdala)和海馬(hippocampus)在HPA軸調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。其中杏仁核是調(diào)節(jié)條件性恐懼獲得、表達(dá)和消退的關(guān)鍵核團(tuán),而海馬作為應(yīng)激反應(yīng)的整合部位,是調(diào)節(jié)情緒反應(yīng)和認(rèn)知行為功能的重要腦區(qū),對(duì)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶有著基本的作用,同時(shí)具有高度的突觸可塑性。胚胎期和出生早期各種環(huán)境因素的改變均可影響海馬和杏仁核突觸結(jié)構(gòu)的構(gòu)建與功能的完善,進(jìn)而導(dǎo)致出生后腦功能受損。突觸前膜的突觸素I(synapsin I)對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放起調(diào)節(jié)作用,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元之間突觸聯(lián)系的形成和維持。突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density proteins-95,PSD-95)在突觸結(jié)構(gòu)、功能和可塑性等方面發(fā)揮重要作用。除synapsin I和PSD-95以外,定位于突觸的細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)在影響突觸形成的同時(shí),也可以通過(guò)與其他突觸蛋白之間的相互作用,參與信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)突觸之間的信號(hào)傳遞,影響突觸功能。如neurexin I和neuroligin-1/-2可以通過(guò)影響大腦中興奮性和抑制性神經(jīng)傳遞之間的平衡,改變海馬和杏仁核神經(jīng)元長(zhǎng)期的記憶儲(chǔ)存和恐懼調(diào)節(jié),進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。因此我們提出“新生隔離”(neonatal isolation,NI)這種短期重復(fù)隔離模式作為早期的心理應(yīng)激源,是否會(huì)通過(guò)GR受體引起單一連續(xù)應(yīng)激(single prolonged stress,SPS)方法構(gòu)建的成年P(guān)TSD模型大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元突觸穩(wěn)態(tài)的改變,影響興奮性/抑制性突觸的比例以及興奮和抑制電流平衡,進(jìn)而導(dǎo)致腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接的異常,影響成年后的情感、認(rèn)知及學(xué)習(xí)記憶能力,構(gòu)成PTSD的易感性因素。本研究通過(guò)三種行為學(xué)實(shí)驗(yàn),曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test,OF),高架十字迷宮(elevated plus maze test,EPM)及Morris水迷宮(morris water maz,MWM)檢測(cè)NI-SPS大鼠的自發(fā)性探索行為、焦慮程度和空間學(xué)習(xí)記憶能力。從形態(tài)學(xué),蛋白水平,基因水平來(lái)探索GR及synapsin I、PSD-95、neurexin I、neuroligin-1/-2在NI和SPS大鼠海馬、杏仁核的表達(dá)變化。結(jié)合NI-SPS大鼠的行為學(xué)測(cè)定,研究ELA是否可以通過(guò)GR調(diào)控PTSD大鼠的神經(jīng)可塑性,參與大鼠應(yīng)激反應(yīng)、記憶與情感障礙的病理生理過(guò)程,為深入揭示PTSD的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。研究方法:1、動(dòng)物模型制作、實(shí)驗(yàn)分組及生理指標(biāo)測(cè)量:采用的雌性Wistar孕鼠,自由攝食飲水飼養(yǎng)至生產(chǎn),分娩的當(dāng)天被指定為出生后第0天(postnatal day 0,PND 0)。本研究中共采用了100只雄性幼鼠,隨機(jī)分為4組(25只/組):1)對(duì)照組:不受任何干擾;2)NI組:僅在PND 2~9接受NI處理,而不接受SPS刺激;3)SPS組:不接受NI處理,僅在PND 56給予SPS刺激;4)NI+SPS組:先在PND 2~9接受NI處理,然后在PND 56接受SPS刺激。幼鼠在PND 22斷奶,在特定的時(shí)間點(diǎn)(PND 22,PND 40和PND 60)測(cè)量大鼠體重,從PND 63開(kāi)始,對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試和取材。2、行為學(xué)測(cè)定:通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)OF、EPM及MWM檢測(cè)各組大鼠自發(fā)性探索行為、焦慮程度和空間學(xué)習(xí)記憶能力。3、免疫組織化學(xué):應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法,從形態(tài)學(xué)角度觀察各組大鼠海馬和杏仁核GR、synapsin I、PSD-95免疫反應(yīng)性變化。4、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定:用ELISA試劑盒測(cè)定各組大鼠應(yīng)激和焦慮時(shí)血漿皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT)水平。5、Western blotting:應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)各組大鼠海馬和杏仁核部位GR、synapsin I、PSD-95、neurexin I、neuroligin-1/-2蛋白表達(dá)變化。6、Real-Time PCR:應(yīng)用Real-Time PCR方法檢測(cè)各組大鼠海馬和杏仁核synapsin I、PSD-95、neurexin I、neuroligin-1/-2 mRNA的表達(dá)變化;7、免疫熒光技術(shù):應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)海馬neuroligin-1/-2的表達(dá)變化。結(jié)果:1、大鼠生理指標(biāo)的測(cè)量:與對(duì)照組相比,NI和SPS大鼠攝食和飲水等情況無(wú)明顯變化,NI或SPS對(duì)大鼠的體重增長(zhǎng)情況均無(wú)顯著影響。2、行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果:OF實(shí)驗(yàn)中,無(wú)論是NI還是SPS對(duì)大鼠總體水平運(yùn)動(dòng)的影響均不顯著,但是NI+SPS組大鼠進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)和運(yùn)動(dòng)距離百分比均顯著低于NI組和SPS組;EPM實(shí)驗(yàn)中,SPS組大鼠的開(kāi)放臂進(jìn)入次數(shù)百分比和時(shí)間百分比顯著低于對(duì)照組和NI組,而且NI+SPS組大鼠顯著低于SPS組;MWM實(shí)驗(yàn)中,NI和SPS對(duì)大鼠總的運(yùn)動(dòng)距離影響也不顯著,但是NI和SPS對(duì)大鼠經(jīng)過(guò)目標(biāo)位置次數(shù)和目標(biāo)象限游泳距離百分比的影響是顯著的,而且NI+SPS組顯著高于SPS組。3、免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果:大鼠海馬和杏仁核GR的免疫反應(yīng)定位于神經(jīng)元的細(xì)胞核和細(xì)胞漿。實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬GR的陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組均增強(qiáng),但是杏仁核GR的陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組均減弱;Synapsin I在對(duì)照組大鼠海馬和杏仁核顯示的陽(yáng)性反應(yīng)相對(duì)淡染,主要分布在神經(jīng)元的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。NI處理后,海馬和杏仁核的synapsin I免疫反應(yīng)增強(qiáng)。SPS組大鼠海馬synapsin I陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng),而杏仁核的陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組減弱;PSD-95抗體陽(yáng)性細(xì)胞的免疫組化染色為棕色,免疫反應(yīng)主要見(jiàn)于海馬和杏仁核神經(jīng)元的胞漿和突起。NI組大鼠海馬和杏仁核的PSD-95陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)。同時(shí)SPS組海馬PSD-95的陽(yáng)性表達(dá)也增強(qiáng),而杏仁核的陽(yáng)性表達(dá)減弱。4、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定結(jié)果:對(duì)照組和NI組大鼠血漿的基礎(chǔ)CORT水平?jīng)]有顯著差異,而SPS導(dǎo)致大鼠血漿CORT水平顯著升高。另外,NI+SPS組大鼠血漿CORT水平顯著高于對(duì)照組和NI組大鼠。5、Western blotting檢測(cè)結(jié)果:NI組和SPS組大鼠海馬GR蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組,而杏仁核GR蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組,NI+SPS組同SPS組相比,海馬和杏仁核GR蛋白表達(dá)的改變顯著增強(qiáng);Synapsin I和neurexin I蛋白在NI組和NI+SPS組大鼠海馬的表達(dá)顯著低于對(duì)照組,但是在SPS組的表達(dá)顯著增高。而NI組和SPS組杏仁核synapsin I和neurexin I的蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組,而且NI+SPS組顯著低于SPS組;同對(duì)照組相比,NI組和SPS組大鼠海馬PSD-95的蛋白表達(dá)和neuroligin-1/-2蛋白表達(dá)的比值顯著增高,而且NI+SPS組顯著高于SPS組。NI組大鼠杏仁核PSD-95的蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比顯著升高,而SPS組顯著降低。但是NI組和SPS組大鼠杏仁核neuroligin-1/-2的蛋白表達(dá)比例均顯著低于對(duì)照組,而且NI+SPS組顯著低于SPS組。7、Real Time PCR檢測(cè)結(jié)果:SPS刺激后大鼠海馬synapsin I mRNA的表達(dá)同對(duì)照組相比顯著上調(diào),但是在NI組和NI+SPS組的表達(dá)顯著下降。NI和SPS刺激后杏仁核synapsin I mRNA的表達(dá)較對(duì)照組均顯著減少;同對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬PSD-95 mRNA的表達(dá)均顯著增高。NI組杏仁核PSD-95 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組顯著升高,而SPS組顯著降低;經(jīng)過(guò)NI和SPS刺激后,大鼠海馬和杏仁核neurexin I mRNA與對(duì)照組相比均顯著減少,海馬neuroligin-1/-2 mRNA表達(dá)的比值均顯著高于對(duì)照組,而杏仁核均顯著低于對(duì)照組。7、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)結(jié)果:對(duì)照組neuroligin-1和-2在海馬腦區(qū)部分細(xì)胞中高表達(dá),不僅在細(xì)胞質(zhì)中共同定位,而且在突起中也共同定位,但是軸突染色較少。NI組大鼠海馬腦區(qū)大部分細(xì)胞呈極低的neuroligin-1和-2免疫反應(yīng),神經(jīng)突起中未表達(dá)。而在SPS組大鼠海馬中大多數(shù)細(xì)胞共同表達(dá)neuroligin-1-和-2,在許多較長(zhǎng)的細(xì)胞突起中共同定位。在NI+SPS組大鼠海馬中大多數(shù)共同表達(dá)的neuroligin-1和-2在較低水平,在細(xì)胞突起中共定位,但是在神經(jīng)纖維的數(shù)目少于SPS組。結(jié)論:1、與對(duì)照組相比,NI組大鼠在焦慮方面沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的變化,但是與SPS組大鼠相比,NI+SPS組大鼠在OF和EPM試驗(yàn)中表現(xiàn)出更高的焦慮水平,說(shuō)明經(jīng)歷過(guò)早期應(yīng)激的大鼠在成年期可能更容易受到負(fù)性經(jīng)歷的影響。2、早期NI并不影響成年大鼠血漿CORT水平,然而SPS組和NI+SPS組大鼠血漿CORT水平增加,那么GR就成為早期應(yīng)激動(dòng)物模型中HPA軸功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。3、NI組和SPS組大鼠海馬GR的表達(dá)水平顯著增高,杏仁核GR表達(dá)的改變與海馬完全相反,而且NI增加了海馬和杏仁核這些改變。4、同時(shí)NI加重了SPS成年大鼠海馬突觸后膜和杏仁核突觸前膜神經(jīng)元件的變化,并且增加了海馬和杏仁核興奮性和抑制性突觸比例的改變。綜上所述,早期應(yīng)激引起大鼠的海馬和杏仁核HPA軸功能和突觸可塑性改變可能會(huì)持續(xù)至機(jī)體成年,進(jìn)而加重了SPS大鼠遭受創(chuàng)傷時(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變化,增加PTSD的易感性。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R749.5;R-332
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組將 100 只雄性幼鼠隨機(jī)分為 4 組（25 只/組）：1) 對(duì)照組：不受任何干擾；2) NI 組：僅在 PND 2~9 接受 NI 處理，而不接受 SPS 刺激；3) SPS 組：不接受NI 處理，僅在 PND 56 給予 SPS 刺激；4) NI+SPS 組：先在 PND 2~9 接受 NI 處理，然后在 PND 56 接受 SPS 刺激。幼鼠在 PND 22 斷奶，在特定的時(shí)間點(diǎn)測(cè)量大鼠體重，從 PND 63 開(kāi)始，對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試和取材。圖 1 顯示了動(dòng)物的處理步驟。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡圖。注：A：對(duì)照組，B：NI 組，C：SPS 組，D：NI+SPS 組。表 2 NI 和 SPS 對(duì)成年大鼠自主運(yùn)動(dòng)與探究行為的影響曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中各組大鼠總的運(yùn)動(dòng)距離，進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)和中心區(qū)域運(yùn)動(dòng)比較。每組包括 15 只雄性大鼠，數(shù)據(jù)表示為均值±SEM。*P<0.001，與性差異；#P<0.001，與 SPS 組比較有顯著性差異；&P < 0.001，與 NI 組。架十字迷宮結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳偉恒;陶長(zhǎng)路;時(shí)美玉;張繼川;徐程;劉北明;畢國(guó)強(qiáng);;突觸可塑性與腦疾病的神經(jīng)發(fā)育基礎(chǔ)[J];生命科學(xué);2014年06期

2 安獻(xiàn)麗;鄭希耕;;創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的動(dòng)物模型及其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制[J];心理科學(xué)進(jìn)展;2008年03期

本文編號(hào)：2731352