【摘要】：背景鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶4(Calmodulin-dependent protein kinase Ⅳ,CaMKⅣ)是細(xì)胞內(nèi)Ca2+下游信號(hào)分子之一,可干預(yù)Ca2+依賴性肌基因表達(dá),影響骨骼肌再生、重塑并決定肌纖維異質(zhì)性。此外,CaMKⅣ是調(diào)節(jié)外周免疫和炎癥的關(guān)鍵分子,干預(yù)淋巴細(xì)胞激活、增殖和終末分化。我們的前期研究證實(shí),急性肌損傷后,再生肌纖維能分泌多種免疫分子,并顯著上調(diào)CaMKⅣ 水平。人為地持續(xù)上調(diào)體內(nèi)CaMKⅣ將加重肌內(nèi)炎癥。生理?xiàng)l件下,骨骼肌組織內(nèi)環(huán)境改變(如持續(xù)運(yùn)動(dòng),高脂飲食等)可啟動(dòng)肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum Stress,ER Stress)并激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)。這種適應(yīng)機(jī)制能幫助肌質(zhì)網(wǎng)(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。病理性肌損傷(如特發(fā)性自身免疫性肌炎,IIMs)則可能誘發(fā)過度持續(xù)的ER Stress,導(dǎo)致肌細(xì)胞凋亡,并加重肌內(nèi)炎癥。持續(xù)促炎刺激能激活肌纖維ER Stress并誘發(fā)UPR反應(yīng),這提示肌纖維免疫分子表達(dá)與UPR的關(guān)聯(lián)。研究表明,UPR參與免疫細(xì)胞的增殖、分化及功能表達(dá),有助于免疫細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。那么,內(nèi)源性的CaMKⅣ信號(hào)是否通過UPR影響肌纖維免疫特性呢?目前尚無相關(guān)的研究報(bào)道。本課題將探討炎性環(huán)境中肌纖維ER Stress激活,以及CaMKⅣ信號(hào)對(duì)肌內(nèi)ER Stress的干擾效應(yīng),明確CaMKⅣ-UPR通路影響肌纖維免疫特性的可能性。目的1.分析體外促炎環(huán)境中,內(nèi)源CaMKⅣ基因的敲低是否會(huì)影響肌細(xì)胞的免疫特性。2.分析并明確CaMKⅣ-UPR途徑影響肌纖維免疫特性的可能性。方法:1.C2C12細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng),并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行CaMKⅣ shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染,RT-qPCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞的CaMKⅣ敲低效率。2.體外培養(yǎng)CaMKⅣ敲低/未敲低的C2C12細(xì)胞,馬血清誘導(dǎo)分化,γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)致炎刺激。RT-qPCR、Western Blot和免疫熒光染色分析成肌細(xì)胞/分化肌纖維免疫分子表達(dá)。流式分析CaMKⅣ敲低/未敲低成肌細(xì)胞和分化肌管中CD40、CD86、和細(xì)胞間黏附分子-1(cell adhesion molecules,ICM)分子的表達(dá)改變情況。3.體外培養(yǎng)CaMKⅣ敲低/未敲低的C2C12細(xì)胞,馬血清誘導(dǎo)分化,IFN-γ致炎刺激。添加毒胡蘿卜素(Thapsigargin,Tg)或4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)以激動(dòng)/阻斷肌纖維內(nèi)ER Stress;RT-qPCR、Western Blot和免疫熒光染色檢測(cè)C2C12肌纖維UPR通路分子的激活及免疫分子的表達(dá)改變。結(jié)果1.CaMKⅣ shRNA轉(zhuǎn)染后,C2C12細(xì)胞的CaMKⅣ基因及蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。敲低細(xì)胞體外增殖狀態(tài)良好,馬血清能誘導(dǎo)細(xì)胞分化融合,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.IFN-γ可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞及分化肌管表達(dá)或上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體-I(Major histocompatibility-I,MHC-I(H-2Kb)),MHC-Ⅱ(H2-Ea),Toll樣受體家族-3(Toll-like receptors-3,TLR3),CD40,CD86,ICM-1,以及一些肌促炎因子(myokines)。CaMKⅣ基因敲低細(xì)胞內(nèi),上述炎癥分子的水平顯著下調(diào)。這表明,內(nèi)源性CaMKⅣ基因參與上調(diào)肌細(xì)胞免疫分子的表達(dá)。3.IFN-γ促炎刺激可誘導(dǎo)分化肌管上調(diào)UPR通路中的真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α,eILF2α)和需肌醇酶 1a(inositol-requiring enzyme-1α,IRE1α)分子水平。但Tg誘導(dǎo)持續(xù)ER Stress時(shí),肌纖維免疫分子的表達(dá)顯著下調(diào)。CaMKⅣ基因敲低后,接受IFN-γ處理的C2C12肌纖維進(jìn)一步上調(diào)UPR通路分子,但肌纖維免疫分子的表達(dá)水平較未敲低的細(xì)胞顯著下調(diào)。這提示,CaMKⅣ信號(hào)可通過UPR反應(yīng)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞免疫分子表達(dá)。結(jié)論體外炎性環(huán)境中,內(nèi)源性CaMKⅣ信號(hào)可能經(jīng)由UPR反應(yīng)調(diào)節(jié)肌纖維的免疫功能。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

１．３．１邋ＣａＭＫｌＶ邋ｓｈＲＮＡ邋抑制邋Ｃ２Ｃ邋丨邋２邋細(xì)胞邋ＣａｌＶＩＫｌＶ的表達(dá)逡逑ＲＴ－ｑＰＣ’Ｒ結(jié)果顯示，Ｕ對(duì)照細(xì)胞（ＣｏｎｔｒｏｌｓｈＲＮＡ轉(zhuǎn)染的Ｃ２Ｃ１２細(xì)胞）相逡逑比，ＣａＭＫｌＶ敲低細(xì)胞內(nèi)ＣａＭＫｌＶ邋ｍＲＮＡ的表達(dá)水平明顯下調(diào)（圖１－１Ａ）。逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ結(jié)果顯示，在蛋白表達(dá)水平上，與對(duì)照細(xì)胞相比，ＣａＭＫｌＶ敲逡逑低細(xì)胞內(nèi)ＣａＭＫｌＶ蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)（圖１－１Ｂ）。逡逑＾邋＞邋１．５－｜邐Ｂ邐０．８－１逡逑１＿邋｜邋＊逡逑ｕ邋２邐＊＊邐．邐５邋０．６－邋Ｊ１邐１逡逑ｓｒ，邐？０．４－工逡逑ｉ｜。５．邋＿邋ｈ邋ｃａＭＫｉ＾ＢＢＢＨＩ５５邐＿邋╁義希殄危牽粒校模儒危常峰危眩螣a逡逑、Ｚ邋ｑＺ邐Ｚ逡逑圖１－１．邋ＣａＭＫｌＶ邋ｓｈＲＮＡ抑制Ｃ２Ｃ１２細(xì)胞ＣａＭＫｌＶ基因的表達(dá)。逡逑圖丨－１Ａ．邋ＲＴ－ｑＰＣＲ檢測(cè)ＣａＭＫｌＶ邋ｍＲＮＡ的水ｆ分析；逡逑１７逡逑

逡逑圖１－１８．？６５１６１＊１１８１0１檢測(cè)＃常保埽矗暴g氦蛋白的酸澖分析；（與對(duì)照細(xì)般|啾齲嗑

本文編號(hào)：2728808