發(fā)布時(shí)間：2020-06-24 21:52

【摘要】：研究背景:Naive狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞一直被研究者們認(rèn)為是真正的胚胎干細(xì)胞,然而迄今為止,有蹄類大動(dòng)物的naive胚胎干細(xì)胞始終未能成功建系。最新研究表明,利用攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體轉(zhuǎn)染豬的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán),然后將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)接種于含2i(CHIR99021和PD0325901)的LIF培養(yǎng)液中,可以獲得豬類naive胚胎干細(xì)胞,然而這樣獲得的豬類naive胚胎干細(xì)胞由于來源于可能攜帶不同拷貝外源轉(zhuǎn)錄因子的不同的卵裂球,而不具有均一性。本實(shí)驗(yàn)室此前將經(jīng)典的鼠源多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc(mOSKM)表達(dá)載體通過核轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)入豬胎兒成纖維細(xì)胞(PEF),再通過體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得胚胎,并將其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)接種于含3i(CHIR99021,PD0325901,SB431542)的LIF培養(yǎng)液中,成功建立了豬naive-like胚胎干細(xì)胞系,但尚未對(duì)所建細(xì)胞系的內(nèi)外源轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究。目前關(guān)于豬多潛能干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞鮮有報(bào)道,豬多潛能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的分化缺少相關(guān)文獻(xiàn)支持,因而尚無確切的豬胚胎干細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞的方法。此外,豬類胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為中胚層的方法尚無確定的標(biāo)準(zhǔn),關(guān)于人和鼠胚胎干細(xì)胞向中胚層譜系類腎細(xì)胞分化的研究方法主要有特定誘導(dǎo)因子定向誘導(dǎo)分化、腎細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化和經(jīng)擬胚體途徑定向分化等策略。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室所建立的豬naive-like胚胎干細(xì)胞系,在對(duì)其干細(xì)胞特性進(jìn)行進(jìn)一步鑒定和驗(yàn)證的基礎(chǔ)上,研究了外源轉(zhuǎn)錄因子對(duì)內(nèi)源Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc啟動(dòng)表達(dá)的影響及豬naive-like胚胎干細(xì)胞體外定向分化的能力,為獲得主要內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子全面啟動(dòng)的豬胚胎干細(xì)胞以及豬多能干細(xì)胞體外定向分化方法的建立提供參考。研究目的:鑒定豬naive-like多能干細(xì)胞內(nèi)外源多能基因的表達(dá)情況;研究豬naive-like胚胎干細(xì)胞向外胚層譜系神經(jīng)前體細(xì)胞和中胚層譜系腎前體細(xì)胞分化的能力。研究方法:對(duì)已建立的豬naive-like胚胎干細(xì)胞系進(jìn)行多能因子免疫熒光染色,并通過Q-PCR和免疫熒光染色鑒定細(xì)胞系特征;所建立的1、4號(hào)細(xì)胞系經(jīng)去除DOX培養(yǎng)后,提取細(xì)胞系總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,設(shè)計(jì)Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc引物進(jìn)行RT-PCR后切膠回收,轉(zhuǎn)化涂板挑克隆后送測(cè)序,通過對(duì)比內(nèi)外源克隆占比了解細(xì)胞系在去除DOX培養(yǎng)后內(nèi)外源基因的表達(dá)變化程度;利用小分子化合物β-巰基乙醇、B-27、肝素等組成的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液,采用直接分化法,分化得到神經(jīng)前體細(xì)胞,通過RT-PCR和Q-PCR對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)特異性基因表達(dá)鑒定,同時(shí)檢測(cè)分化后的細(xì)胞是否已經(jīng)喪失多能性,通過Western Blot和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)標(biāo)志物Nf-l、βIII-Tubulin的表達(dá)水平;利用小分子BMP4、Activin A、CHIR99021、FGF9、Herparin和RA,采用三步法,獲得腎前體細(xì)胞,通過RT-PCR和Q-PCR對(duì)其進(jìn)行腎特異性基因表達(dá)鑒定,并通過Western Blot和免疫熒光檢測(cè)腎細(xì)胞標(biāo)志物WT-1的表達(dá)量。研究結(jié)果:對(duì)豬naive-like胚胎干細(xì)胞系進(jìn)行多能因子免疫熒光染色,結(jié)果顯示Oct4、Sox2在細(xì)胞中基因高表達(dá),通過Q-PCR證明naive-like狀態(tài)的細(xì)胞與primed狀態(tài)相比Xist基因表達(dá)要低,且在雌性細(xì)胞系中,通過細(xì)胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)primed狀態(tài)的有巴氏小體存在,而naive-like狀態(tài)的幾乎沒有巴氏小體存在,證明獲得的naive-like ESCs更趨近于naive狀態(tài);去除DOX培養(yǎng)1號(hào)和4號(hào)豬naive-like胚胎干細(xì)胞系,通過TA克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)1號(hào)細(xì)胞系在去除DOX之前內(nèi)源OSKM四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均有所表達(dá),內(nèi)源表達(dá)量分別占總表達(dá)量的3.2%、35.0%、9.4%和9.5%,去除DOX后,內(nèi)源Sox2和c-Myc的表達(dá)分別提高至78.3%和21.7%,而內(nèi)源Oct4和c-Myc未見提高。4號(hào)細(xì)胞系在DOX存在的情況下,只有內(nèi)源Sox2有所啟動(dòng)表達(dá),占比為10.0%,在去除DOX之后,內(nèi)源Sox2的表達(dá)最高達(dá)到100%,而內(nèi)源Oct4、Klf4和c-Myc均未啟動(dòng)表達(dá)。通過小分子誘導(dǎo)分化所得到的神經(jīng)前體細(xì)胞具有明顯的神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)特征,RT-PCR顯示分化后的神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)多種神經(jīng)細(xì)胞特異性基因,Q-PCR結(jié)果顯示分化后多能因子的表達(dá)顯著降低,神經(jīng)特異性基因表達(dá)顯著升高。免疫熒光染色結(jié)果和Western Blot顯示細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)標(biāo)志物βIII-Tubulin和Nf-l。利用小分子先將豬naive-like胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)至中間中胚層,再通過不同的小分子組合將中間中胚層細(xì)胞誘導(dǎo)為腎前體細(xì)胞,RT-PCR和Q-PCR鑒定結(jié)果表明分化細(xì)胞其中胚層譜系及腎細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)顯著增高,Western Blot和免疫熒光結(jié)果顯示分化后的腎前體細(xì)胞中表達(dá)腎臟標(biāo)志物Wt-1。研究結(jié)論:驗(yàn)證了豬naive-like胚胎干細(xì)胞系的干細(xì)胞特性,不同的細(xì)胞系內(nèi)外源轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況不盡相同,但所建細(xì)胞系都一定程度上依賴于外源轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。在去除DOX誘導(dǎo)之后,內(nèi)源Sox2的啟動(dòng)對(duì)于干細(xì)胞的生長(zhǎng)及持續(xù)的自我更新至關(guān)重要。成功實(shí)現(xiàn)了體外直接誘導(dǎo)豬naive-like胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞和腎前體細(xì)胞分化,為豬naive胚胎干細(xì)胞的建系及其誘導(dǎo)分化方法的建立提供參考。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R-33;Q813.11
【圖文】：

三維立體狀（圖 1）；對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示豬 naive-like 胚胎干細(xì)胞表達(dá)主要多能性因子 Oct4 和 Sox2（圖 2）。圖-1 豬 naive-like 胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)A：pES 細(xì)胞克隆 P0 代（×100）；B：pES 細(xì)胞克隆 P3 代（×100）；C：pES 細(xì)胞克隆 P20 代（×40）；D：pES 細(xì)胞克隆 P45 代（×40）

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文19圖-2 豬 naive-like 胚胎干細(xì)胞 Oct4、Sox2 免疫熒光染色（×200）2. 豬 naive-like 胚胎干細(xì)胞核型分析及生長(zhǎng)曲線繪制選取 3 號(hào)細(xì)胞系 25 代和 4 號(hào)細(xì)胞系 38 代進(jìn)行核型分析，染色體配對(duì)及核型結(jié)果如圖 3A-B 所示 ，豬 naive-like 胚胎干細(xì)胞核型正常；將鼠和豬的胚胎干細(xì)胞同步培養(yǎng)并繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖 3C�；诿� 24 小時(shí)的胚胎干細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)三天后細(xì)胞開始指數(shù)增長(zhǎng)；七天后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度進(jìn)入平臺(tái)期。以上結(jié)果表明，豬 naive-like 胚胎干細(xì)胞增殖速度較快，增長(zhǎng)速率與小鼠胚胎干細(xì)胞接近。

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本文編號(hào)：2728404