【摘要】：研究背景:Naive狀態(tài)的胚胎干細胞一直被研究者們認為是真正的胚胎干細胞,然而迄今為止,有蹄類大動物的naive胚胎干細胞始終未能成功建系。最新研究表明,利用攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體轉(zhuǎn)染豬的囊胚內(nèi)細胞團,然后將內(nèi)細胞團接種于含2i(CHIR99021和PD0325901)的LIF培養(yǎng)液中,可以獲得豬類naive胚胎干細胞,然而這樣獲得的豬類naive胚胎干細胞由于來源于可能攜帶不同拷貝外源轉(zhuǎn)錄因子的不同的卵裂球,而不具有均一性。本實驗室此前將經(jīng)典的鼠源多能性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc(mOSKM)表達載體通過核轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)入豬胎兒成纖維細胞(PEF),再通過體細胞克隆技術(shù)獲得胚胎,并將其內(nèi)細胞團接種于含3i(CHIR99021,PD0325901,SB431542)的LIF培養(yǎng)液中,成功建立了豬naive-like胚胎干細胞系,但尚未對所建細胞系的內(nèi)外源轉(zhuǎn)錄因子的表達進行較為系統(tǒng)的研究。目前關(guān)于豬多潛能干細胞定向分化為神經(jīng)細胞鮮有報道,豬多潛能干細胞體外誘導(dǎo)神經(jīng)細胞的分化缺少相關(guān)文獻支持,因而尚無確切的豬胚胎干細胞定向分化誘導(dǎo)為神經(jīng)細胞的方法。此外,豬類胚胎干細胞體外誘導(dǎo)分化為中胚層的方法尚無確定的標準,關(guān)于人和鼠胚胎干細胞向中胚層譜系類腎細胞分化的研究方法主要有特定誘導(dǎo)因子定向誘導(dǎo)分化、腎細胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)胚胎干細胞分化和經(jīng)擬胚體途徑定向分化等策略。本研究利用本實驗室所建立的豬naive-like胚胎干細胞系,在對其干細胞特性進行進一步鑒定和驗證的基礎(chǔ)上,研究了外源轉(zhuǎn)錄因子對內(nèi)源Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc啟動表達的影響及豬naive-like胚胎干細胞體外定向分化的能力,為獲得主要內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子全面啟動的豬胚胎干細胞以及豬多能干細胞體外定向分化方法的建立提供參考。研究目的:鑒定豬naive-like多能干細胞內(nèi)外源多能基因的表達情況;研究豬naive-like胚胎干細胞向外胚層譜系神經(jīng)前體細胞和中胚層譜系腎前體細胞分化的能力。研究方法:對已建立的豬naive-like胚胎干細胞系進行多能因子免疫熒光染色,并通過Q-PCR和免疫熒光染色鑒定細胞系特征;所建立的1、4號細胞系經(jīng)去除DOX培養(yǎng)后,提取細胞系總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,設(shè)計Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc引物進行RT-PCR后切膠回收,轉(zhuǎn)化涂板挑克隆后送測序,通過對比內(nèi)外源克隆占比了解細胞系在去除DOX培養(yǎng)后內(nèi)外源基因的表達變化程度;利用小分子化合物β-巰基乙醇、B-27、肝素等組成的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液,采用直接分化法,分化得到神經(jīng)前體細胞,通過RT-PCR和Q-PCR對其進行神經(jīng)特異性基因表達鑒定,同時檢測分化后的細胞是否已經(jīng)喪失多能性,通過Western Blot和細胞免疫熒光檢測神經(jīng)標志物Nf-l、βIII-Tubulin的表達水平;利用小分子BMP4、Activin A、CHIR99021、FGF9、Herparin和RA,采用三步法,獲得腎前體細胞,通過RT-PCR和Q-PCR對其進行腎特異性基因表達鑒定,并通過Western Blot和免疫熒光檢測腎細胞標志物WT-1的表達量。研究結(jié)果:對豬naive-like胚胎干細胞系進行多能因子免疫熒光染色,結(jié)果顯示Oct4、Sox2在細胞中基因高表達,通過Q-PCR證明naive-like狀態(tài)的細胞與primed狀態(tài)相比Xist基因表達要低,且在雌性細胞系中,通過細胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)primed狀態(tài)的有巴氏小體存在,而naive-like狀態(tài)的幾乎沒有巴氏小體存在,證明獲得的naive-like ESCs更趨近于naive狀態(tài);去除DOX培養(yǎng)1號和4號豬naive-like胚胎干細胞系,通過TA克隆測序發(fā)現(xiàn)1號細胞系在去除DOX之前內(nèi)源OSKM四個轉(zhuǎn)錄因子均有所表達,內(nèi)源表達量分別占總表達量的3.2%、35.0%、9.4%和9.5%,去除DOX后,內(nèi)源Sox2和c-Myc的表達分別提高至78.3%和21.7%,而內(nèi)源Oct4和c-Myc未見提高。4號細胞系在DOX存在的情況下,只有內(nèi)源Sox2有所啟動表達,占比為10.0%,在去除DOX之后,內(nèi)源Sox2的表達最高達到100%,而內(nèi)源Oct4、Klf4和c-Myc均未啟動表達。通過小分子誘導(dǎo)分化所得到的神經(jīng)前體細胞具有明顯的神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)特征,RT-PCR顯示分化后的神經(jīng)前體細胞表達多種神經(jīng)細胞特異性基因,Q-PCR結(jié)果顯示分化后多能因子的表達顯著降低,神經(jīng)特異性基因表達顯著升高。免疫熒光染色結(jié)果和Western Blot顯示細胞表達神經(jīng)標志物βIII-Tubulin和Nf-l。利用小分子先將豬naive-like胚胎干細胞誘導(dǎo)至中間中胚層,再通過不同的小分子組合將中間中胚層細胞誘導(dǎo)為腎前體細胞,RT-PCR和Q-PCR鑒定結(jié)果表明分化細胞其中胚層譜系及腎細胞相關(guān)基因表達顯著增高,Western Blot和免疫熒光結(jié)果顯示分化后的腎前體細胞中表達腎臟標志物Wt-1。研究結(jié)論:驗證了豬naive-like胚胎干細胞系的干細胞特性,不同的細胞系內(nèi)外源轉(zhuǎn)錄因子的表達情況不盡相同,但所建細胞系都一定程度上依賴于外源轉(zhuǎn)錄因子的表達。在去除DOX誘導(dǎo)之后,內(nèi)源Sox2的啟動對于干細胞的生長及持續(xù)的自我更新至關(guān)重要。成功實現(xiàn)了體外直接誘導(dǎo)豬naive-like胚胎干細胞向神經(jīng)前體細胞和腎前體細胞分化,為豬naive胚胎干細胞的建系及其誘導(dǎo)分化方法的建立提供參考。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R-33;Q813.11
【圖文】：

三維立體狀（圖 1）；對該細胞進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示豬 naive-like 胚胎干細胞表達主要多能性因子 Oct4 和 Sox2（圖 2）。圖-1 豬 naive-like 胚胎干細胞傳代培養(yǎng)A：pES 細胞克隆 P0 代（×100）；B：pES 細胞克隆 P3 代（×100）；C：pES 細胞克隆 P20 代（×40）；D：pES 細胞克隆 P45 代（×40）

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文19圖-2 豬 naive-like 胚胎干細胞 Oct4、Sox2 免疫熒光染色（×200）2. 豬 naive-like 胚胎干細胞核型分析及生長曲線繪制選取 3 號細胞系 25 代和 4 號細胞系 38 代進行核型分析，染色體配對及核型結(jié)果如圖 3A-B 所示 ，豬 naive-like 胚胎干細胞核型正常；將鼠和豬的胚胎干細胞同步培養(yǎng)并繪制生長曲線，結(jié)果見圖 3C�；诿� 24 小時的胚胎干細胞計數(shù)結(jié)果繪制生長曲線，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)三天后細胞開始指數(shù)增長；七天后，細胞生長速度進入平臺期。以上結(jié)果表明，豬 naive-like 胚胎干細胞增殖速度較快，增長速率與小鼠胚胎干細胞接近。

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4 ;我院黃承揚研究組在胚胎干細胞命運決定機制研究中取得重要進展[J];汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2017年01期

5 ;新技術(shù)“打印”出人體胚胎干細胞[J];中華細胞與干細胞雜志(電子版);2013年01期

6 ;歐盟啟動胚胎干細胞分化機理的大型研究項目[J];中國家禽;2012年06期

7 ;CRTER雜志關(guān)注“胚胎干細胞”研究熱點[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年06期

8 高逸飛;;胚胎干細胞曙光再現(xiàn)[J];中國醫(yī)院院長;2011年21期

9 T.J.艾奇遜;托里·米努斯;;正確的決定[J];科技創(chuàng)業(yè);2011年09期

10 燕衛(wèi)東;吳春華;;胚胎干細胞的研究進展[J];赤峰學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版);2010年02期

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4 王樹玉;張軍;任國慶;;胚胎干細胞的研究進展[A];第五屆全國優(yōu)生科學(xué)大會論文匯編[C];2000年

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9 鹿群;卵母細胞激活技術(shù)與胚胎干細胞分離、培養(yǎng)[D];山東大學(xué);2005年

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本文編號：2728404