本文關(guān)鍵詞：成人Muse結(jié)胞分離、分化及定向誘導(dǎo)為Musc-NPCs的基礎(chǔ)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的利用最新報(bào)道的干細(xì)胞—多系分化持續(xù)應(yīng)激(Muse)細(xì)胞能向三個(gè)胚層分化的多能干細(xì)胞特性,從成人骨髓中分離Muse細(xì)胞,體外誘導(dǎo)為神經(jīng)前體細(xì)胞(Muse-NPCs),建立一套簡單方便的分離、分化、鑒定體系,為今后細(xì)胞治療修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供新的種子細(xì)胞。方法 利用密度梯度離心法和差速貼壁法從健康成人骨髓中分離出人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(hBMSCs),免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法和流式細(xì)胞儀技術(shù)對其進(jìn)行鑒定；體外擴(kuò)增后應(yīng)用流式細(xì)胞分選技術(shù)從hBMSCs中分離出Muse細(xì)胞,長時(shí)間胰蛋白酶應(yīng)激法鑒定其胰酶耐受性,CCK-8法和流式細(xì)胞儀技術(shù)對其細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行檢測,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法和qPCR技術(shù)檢測其多能干細(xì)胞特性及向三胚層分化的能力;通過神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)Muse細(xì)胞分化為Muse-NPCs,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色和qPCR技術(shù)鑒定其神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)情況,CCK-8法和流式細(xì)胞儀技術(shù)對其細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行檢測；運(yùn)用慢病毒載體體外將熒光蛋白cherry轉(zhuǎn)染至Muse-NPCs,使其帶有紅色熒光標(biāo)記,為體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。結(jié)果hBMSCs細(xì)胞表型呈 CD45-/CD11b-/CD90+。流式細(xì)胞分選技術(shù)從中成功分離出Muse細(xì)胞,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定其細(xì)胞表型為SSEA-3+/CD105+,懸浮培養(yǎng)時(shí)呈球狀生長,生長狀態(tài)良好、穩(wěn)定,一定時(shí)間內(nèi)處于持續(xù)增殖狀態(tài)；胰蛋白酶孵育8h后,絕大部分Muse細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定,胞體維持大而透亮的形態(tài),免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法和qPCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示Muse細(xì)胞表達(dá)Nanog、Oct4、Sox2等多能干細(xì)胞標(biāo)記物,且mRNA表達(dá)水平明顯高于hBMSCs; Muse細(xì)胞貼壁后分化為不規(guī)則形態(tài),免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法和qPCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示其分別表達(dá)三胚層標(biāo)記物a-SMA、α-fetoprotein和NF-M。經(jīng)神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)生成的Muse-NPCs呈干細(xì)胞球團(tuán)狀懸浮生長,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法和qPCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示其表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、NCAM和DCX,且mRNA表達(dá)水平明顯高于hBMSCs-NPCs和Muse細(xì)胞；Muse-NPCs生長狀態(tài)穩(wěn)定,體外培養(yǎng)3d內(nèi)增殖迅速,然后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期；慢病毒載體包裝熒光蛋白cherry體外轉(zhuǎn)染Muse-NPCs,可見細(xì)胞自發(fā)紅色熒光,熒光標(biāo)記率達(dá)到95%以上,細(xì)胞狀態(tài)良好。結(jié)論從成人骨髓中成功分離出Muse細(xì)胞,具有多能干細(xì)胞特性,生長狀態(tài)穩(wěn)定,體外成功誘導(dǎo)形成Muse-NPCs,具有神經(jīng)干細(xì)胞特性,并標(biāo)記紅色熒光蛋白cherry,為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。
【關(guān)鍵詞】：骨髓基質(zhì)細(xì)胞 Muse細(xì)胞 神經(jīng)前體細(xì)胞 多能干細(xì)胞標(biāo)記物 胰蛋白酶 轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 緒論11-15
• 1.1 課題來源、研究的目的和意義11
• 1.2 國內(nèi)外研究概況11-14
• 1.3 論文的主要研究內(nèi)容14-15
• 第二章 材料與方法15-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-19
• 2.1.1 細(xì)胞來源15
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及溶液的配制15-18
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)耗材及儀器18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)流程和方法19-34
• 2.2.1 hBMSCs的分離、培養(yǎng)和傳代19
• 2.2.2 hBMSCs的體外誘導(dǎo)19-20
• 2.2.3 Muse細(xì)胞的分選、培養(yǎng)和分化20-22
• 2.2.4 Muse細(xì)胞的體外定向誘導(dǎo)22
• 2.2.5 ESCs的培養(yǎng)22-24
• 2.2.6 流式細(xì)胞儀檢測hBMSCs表型24
• 2.2.7 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)24-26
• 2.2.8 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力26
• 2.2.9 細(xì)胞周期的檢測26-27
• 2.2.10 活細(xì)胞工作站的應(yīng)用27-28
• 2.2.11 qPCR檢測28-32
• 2.2.12 Muse-NPCs的熒光蛋白cherry轉(zhuǎn)染32-33
• 2.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析33-34
• 第三章 結(jié)果34-56
• 3.1 hBMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定34-38
• 3.1.1 hBMSCs的分離及培養(yǎng)34-36
• 3.1.2 hBMSCs的鑒定36-38
• 3.2 Muse細(xì)胞的分離及培養(yǎng)38-40
• 3.3 Muse細(xì)胞的鑒定40-49
• 3.3.1 Muse細(xì)胞的細(xì)胞表型鑒定40-41
• 3.3.2 Muse細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特性檢測41-43
• 3.3.3 Muse細(xì)胞胰酶應(yīng)激耐受能力的鑒定43-44
• 3.3.4 Muse細(xì)胞的多能干細(xì)胞特性的鑒定44-46
• 3.3.5 Muse細(xì)胞向三個(gè)胚層分化能力的鑒定46-49
• 3.4 體外誘導(dǎo)Muse細(xì)胞分化成Muse-NPCs49-54
• 3.4.1 Muse-NPCs的定向誘導(dǎo)分化49-50
• 3.4.2 Muse-NPCs的鑒定50-54
• 3.5 Muse-NPCs的熒光蛋白cherry轉(zhuǎn)染54-56
• 3.5.1 Muse-NPCs的熒光蛋白cherry轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)54-55
• 3.5.2 Muse-NPCs的熒光蛋白cherry轉(zhuǎn)染正式實(shí)驗(yàn)55-56
• 第四章 討論56-60
• 第五章 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 英文縮寫詞表65-67
• 綜述67-90
• 綜述參考文獻(xiàn)83-90
• 在攻讀碩士學(xué)位期間參加的項(xiàng)目及發(fā)表的論文90-91
• 致謝91

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本文編號：272422