本文關(guān)鍵詞：miR-155在低氧環(huán)境中對間充質(zhì)干細胞免疫因子表達的調(diào)控及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討miR-155在低氧條件下對人臍帶間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)的增殖、周期和免疫因子表達的調(diào)控以及作用機制。方法:將剔除臍動靜脈及臍外膜的新鮮人臍帶剪切成小組織塊,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng),得到貼壁細胞。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài),流式細胞術(shù)檢測細胞表面抗原及細胞周期,CCK-8法進行細胞增殖情況的檢測。通過Lip2000,將mi R-155 mimic、mimic NC轉(zhuǎn)染至hUC-MSCs中,構(gòu)建miR-155高表達的hUC-MSCs。在氯化鈷(CoCl2)模擬的化學低氧環(huán)境中,用脂多糖(LPS)刺激hUC-MSCs的免疫作用,將實驗設置為六組,①空白對照組為未轉(zhuǎn)染的hUC-MSCs、②LPS對照組、③mi R-155 mimic-NC+LPS組、④miR-155 mimic+LPS組、⑤低氧+miR-155 mimic-NC+LPS組、⑥低氧+miR-155 mimic+LPS組。采用實時熒光定量-PCR方法鑒定其轉(zhuǎn)染效果,并檢測免疫相關(guān)基因IL-6、IL-8、iNOS、SDF-1?、TGF-β、HIF-1α的表達。ELISA法檢測上清中分泌的細胞因子IL-6、IL-8、TGF-β及SDF-1α,Western blot法檢測相關(guān)蛋白iNOS、HIF-1α的表達。結(jié)果:體外培養(yǎng)7~10 d后,有細胞從組織塊中爬出;提取并培養(yǎng)擴增的hUC-MSCs形態(tài)一致,外觀呈紡錘形或梭形成纖維細胞樣;流式細胞儀周期檢測結(jié)果顯示,G0/G1期的細胞數(shù)超過80%;生長曲線顯示其增殖能力強;流式檢測hUC-MSCs表面相關(guān)抗原CD29、CD73、CD90、CD105表達陽性,CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR呈陰性表達。CoCl2模擬的化學性低氧可促進hUC-MSCs增殖,且具有一定時間及濃度相關(guān)性。Mi R-155轉(zhuǎn)染有效(P0.05),mi R-155高表達組的細胞因子IL-8、IL-6表達上調(diào),iNOS基因及蛋白的表達均下調(diào),且低氧環(huán)境下HIF-1α基因及蛋白表達增多,并可促進miR-155的調(diào)節(jié)作用,均具有統(tǒng)計學意義(P0.05);而mi R-155對細胞因子SDF-1α、TGF-β的表達無明顯影響,不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:分離獲取的hUC-MSCs,能在體外培養(yǎng)、擴增,可作為組織工程種子細胞來源。CoCl2模擬的體外低氧壞境能促進hUC-MSCs增殖,最佳濃度為200μmol/L,但過高濃度(250μmol/L)時反而抑制其增殖。低氧條件通過上調(diào)HIF-1α的表達,從而下調(diào)i NOS蛋白,由此促進miR-155負向調(diào)控hUC-MSCs的免疫抑制能力。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細胞 低氧 微小RNA-155 誘導型一氧化氮合酶 乏氧誘導因子-1α
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392.12
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文縮略詞7-10
• 第一章 前言10-13
• 第二章 材料與方法13-28
• 2.1 材料13-15
• 2.1.1 組織13
• 2.1.2 主要試劑13-14
• 2.1.3 主要儀器設備14-15
• 2.1.4 實驗室配制溶液15
• 2.2 方法15-28
• 2.2.1 細胞提取及培養(yǎng)15-18
• 2.2.2 細胞增殖實驗及表型鑒定18-19
• 2.2.3 細胞干預及轉(zhuǎn)染19-20
• 2.2.4 實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應20-24
• 2.2.5 Western blot24-28
• 2.2.6 ELISA28
• 2.2.7 統(tǒng)計分析28
• 第三章 結(jié)果28-36
• 3.1 所提取hUC-MSCs的形態(tài)學觀察28-29
• 3.2 所提取hUC-MSCs的增殖能力及表面抗原分析29-30
• 3.2.1 所提取hUC-MSCs的生長曲線分析29-30
• 3.2.2 所提取hUC-MSCs的細胞表面抗原特性30
• 3.2.3 所提取hUC-MSCs的細胞周期分析30
• 3.3 氯化鈷模擬化學低氧的濃度選擇結(jié)果30-33
• 3.3.1 CoCl_2對hUC-MSCs增殖能力的影響30-32
• 3.3.2 CoCl_2對hUC-MSCs細胞周期的影響32-33
• 3.4 MiR-155轉(zhuǎn)染效率的分析結(jié)果33
• 3.5 RT-qPCR法檢測各組hUC-MSCs中IL-6、IL-8、iNOS、SDF-1、TGF-β、HIF-1α m RNA的表達情況33-34
• 3.6 Western blot法檢測各組MSCs中i NOS及HIF-1α 蛋白的表達情況34-35
• 3.7 ELISA法檢測各組hUC-MSCs上清中IL-6、IL-8、SDF-1、TGF-β 細胞因子的表達情況35-36
• 第四章 討論36-40
• 4.1 人臍帶源性MSCs的分離與鑒定36
• 4.2 氯化鈷模擬低氧環(huán)境對hUC-MSCs的研究36-37
• 4.3 Mi R-155在hUC-MSCs中的研究37-38
• 4.4 Mi R-155在低氧環(huán)境中對hUC-MSCs的研究38-40
• 第五章 結(jié)論40-41
• 5.1 結(jié)論40
• 5.2 研究缺陷與展望40-41
• 參考文獻41-45
• 綜述45-52
• 參考文獻49-52
• 在學期間的研究成果52-53
• 致謝53

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本文編號：272531