發(fā)布時間：2020-06-21 12:54

【摘要】：【背景目的】盡管卡介苗(BCG)廣泛應(yīng)用于結(jié)核病(tuberculosis,TB)的預(yù)防已有近100年的歷史,但TB仍然是造成人類死亡的重大感染性疾病之一�？ń槊缈捎行ьA(yù)防兒童的原發(fā)感染,但是其效應(yīng)隨著時間的推移逐漸減弱。因此,迫切需要一種更有效的疫苗來預(yù)防TB。DNA疫苗對TB有預(yù)防和治療效應(yīng),具有熱穩(wěn)定性、易生產(chǎn)及易儲存等優(yōu)點。但是其自身較弱的免疫原性阻礙了DNA疫苗的發(fā)展。DMT是由二甲基雙十八烷基銨(dimethyldioctadecylammonium,DDA)和兩種模式識別受體激動劑單磷酰脂質(zhì)A(Monophosphoryl lipid-A,MPLA)及人工合成的海藻糖6,6’—二分枝菌酸(Trehalose-6,6-dibehenate,TDB)組成的,一種可強力誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生Th1型偏向免疫反應(yīng)的脂質(zhì)體佐劑。為闡明DMT的作用機(jī)制,提高DNA疫苗的免疫效應(yīng),本研究擬構(gòu)建一種新的可分泌表達(dá)融合蛋白CMFO(包括四種結(jié)核分枝桿菌抗原Rv2875,Rv3044,Rv2073c和Rv0577)的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMFO。在細(xì)胞水平證實其分泌表達(dá)。然后,分別制備pCMFO/DDA和pCMFO/DMT兩種DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物,并對其理化性質(zhì)進(jìn)行分析。在C57BL/6小鼠模型中觀察和比較兩種疫苗的免疫原性和抗感染保護(hù)效應(yīng)。【方法】1.pCMFO質(zhì)粒的構(gòu)建:將CMFO核酸序列插入p VAX1載體,構(gòu)建p VAX1-CMFO(pCMFO)重組質(zhì)粒。在293T細(xì)胞中驗證pCMFO質(zhì)粒的分泌表達(dá)。2.pCMFO/DDA和pCMFO/DMT的制備:薄膜法制備DDA和DMT佐劑,然后分別將DDA和DMT與pCMFO混合制備pCMFO/DDA和pCMFO/DMTDNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。3.脂質(zhì)體及DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的表征:分別檢測DDA、DMT、pCMFO/DDA和pCMFO/DMT的粒徑、多分散性(PDI)和Zeta電位;透射電子顯微鏡(TEM)觀察其表面形態(tài)。4.脂質(zhì)體對DNA的吸附和釋放:以初始加入脂質(zhì)體中DNA的總量減去未吸附的DNA含量來計算脂質(zhì)體對DNA吸附的量;將pCMFO/DDA和pCMFO/DMT置于37°C的環(huán)境,不同時間點取樣檢測上清中DNA的含量,以反應(yīng)pCMFO/DDA和pCMFO/DMT脂質(zhì)體復(fù)合物對DNA的釋放。5.小鼠免疫:6-8周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為七組,其中DDA組、DMT組、pCMFO組、pCMFO/DDA組和pCMFO/DMT組小鼠均經(jīng)肌肉注射免疫,200μL/次,間隔三周,共免疫兩次;BCG皮下單次免疫1.0×106 CFU作為陽性對照;PBS作為陰性對照。6.疫苗抗M.tuberculosis H37Rv感染的保護(hù)效應(yīng)評價:初免9周和18周后,小鼠經(jīng)氣溶膠途徑感染M.tuberculosis H37Rv,每只小鼠吸入約60 CFU的細(xì)菌。感染4周后,處死小鼠,取脾臟,肺臟進(jìn)行臟器荷菌量分析,評價疫苗接種對細(xì)菌的清除作用;并對肺臟進(jìn)行病理評分,HE染色和抗酸染色,評價疫苗接種對小鼠病理損傷的改善。7.疫苗接種后小鼠的免疫應(yīng)答:初免后9周和18周,ELISA法檢測小鼠血清中CMFO、Rv0577、Rv2875、Rv3044和Rv2073c抗原特異性的Ig G抗體及其亞類Ig G1和Ig G2a的水平;ELISA法或CBA法檢測小鼠脾上清中Th1(IFN-γ,TNF-α)、Th2(IL-4)和Th17(IL-17A)細(xì)胞因子;流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟CMFO特異性中樞記憶和效應(yīng)記憶T細(xì)胞水平。【結(jié)果】1.pCMFO質(zhì)粒被成功構(gòu)建;且該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞后,在細(xì)胞中分泌表達(dá)CMFO蛋白。2.將兩種激動劑(MPLA和TDB)融入DDA,使脂質(zhì)體顆粒大小更加均一,顆粒之間的聚集減少;相對于DDA脂質(zhì)體,DMT的zeta電位有所降低(P0.05),儲存穩(wěn)定性增強,并且DNA-DMT比DNA-DDA更加緩慢和持久的釋放DNA。3.pCMFO/DMT抗M.tuberculosis H37Rv感染的保護(hù)效應(yīng):在所有組中,PBS對照組脾臟、肺臟荷菌量最多,肺臟病理損傷最嚴(yán)重(P0.05);與PBS組相比,pCMFO、pCMFO/DDA、pCMFO/DMT疫苗接種均導(dǎo)致小鼠脾臟、肺臟荷菌量降低,肺臟病理損傷減輕(P0.05);尤為顯著的是,pCMFO/DMT抗感染效果最好,其短期和長期保護(hù)效應(yīng)均與BCG一致。4.pCMFO/DMT免疫保護(hù)機(jī)制:1)初免后9周,pCMFO/DMT免疫小鼠的血清中產(chǎn)生Rv0577、Rv2875、Rv3044和Rv2073c特異性的Ig G、Ig G1和Ig G2a抗體,且各亞組分Ig G2a/Ig G1比值均大于1,表明免疫反應(yīng)類型趨向于Th1型免疫應(yīng)答。2)初免9周后,與BCG組相比,pCMFO/DMT免疫小鼠的脾細(xì)胞在體外分別受四種亞組分蛋白刺激后,分泌更高水平的Rv0577、Rv2875、Rv3044和Rv2073c特異性的TNF-α(P0.05)和更多的Rv0577、Rv2875和Rv2073c特異性的IFN-γ(P0.05)。3)初免后9周和18周,與pCMFO/DDA組相比,pCMFO/DMT免疫小鼠的血清中產(chǎn)生顯著高水平的CMFO特異性的Ig G、Ig G1和Ig G2a抗體(P0.05);并且pCMFO/DMT免疫小鼠的脾細(xì)胞可分泌更多的CMFO特異性的IFN-γ(P0.05)。4)初免后9周和18周,與pCMFO/DDA相比,pCMFO/DMT均誘導(dǎo)小鼠脾臟產(chǎn)生更高水的CFMO特異性的IL2+TCM細(xì)胞(P0.05)�！窘Y(jié)論】1.pCMFO/DMT疫苗的抗M.tuberculosis感染保護(hù)效果與BCG一致,是一種非常有前景的TB候選疫苗;其作用機(jī)制可能與DMT佐劑運載并且緩慢釋放DNA和兩種受體激動劑(MPLA,TDB)密切相關(guān)。2.本研究為進(jìn)一步開展以DMT為佐劑疫苗的臨床前和臨床研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2724092