【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)以油酸(OA)膠束與雞蛋清溶菌酶(HEWL)為模擬分子,解析淀粉樣蛋白的聚集機(jī)制,并比較不同濃度OA膠束以及OAHEWL聚合體對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的生物學(xué)效應(yīng),初步探討OA膠束對(duì)淀粉樣蛋白斑塊形成的影響,進(jìn)一步提高對(duì)阿爾茲海默癥(AD)病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)。方法:為了保持OA膠束構(gòu)象,所有樣品都在800 rpm、pH 2.3和57℃條件下持續(xù)搖動(dòng);實(shí)驗(yàn)運(yùn)用原子力顯微鏡(AFM)、ThT結(jié)合法、CD光譜法對(duì)淀粉樣蛋白的纖維化過程進(jìn)行初步表征。AFM是研究蛋白質(zhì)聚集過程中動(dòng)態(tài)變化的重要實(shí)驗(yàn)手段,可觀察在不同條件下形成的淀粉樣蛋白寡聚體、原纖維和纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)并測量各結(jié)構(gòu)的高度;采用ThT結(jié)合法監(jiān)測蛋白質(zhì)纖維化的動(dòng)力學(xué)過程;運(yùn)用CD光譜法分析蛋白纖維化過程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。采用WST-1法和熒光顯微鏡連續(xù)成像法觀察不同濃度OA膠束以及不同濃度OA-HEWL聚合體對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞和NSCs的活性影響。結(jié)果:AFM結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,OA100組形成大量的圓形寡聚體,這些寡聚體進(jìn)一步結(jié)合形成纖維狀結(jié)構(gòu),纖維高度最高可達(dá)60nm。ThT熒光染料可與蛋白質(zhì)中的β-折疊結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合,用FluoroMax-2分光光度計(jì)測試蛋白樣品的ThT熒光強(qiáng)度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HEWL組、OA10組、OA100組在50h前,OA100組ThT熒光強(qiáng)度最高,但增長率較緩;50h后,HEWL組增長速度最快,ThT熒光強(qiáng)度持續(xù)增高,高于OA10組和OA100組,而OA100組熒光強(qiáng)度最低。CD光譜結(jié)果顯示,10h時(shí),HEWL組、OA10組、OA100組所得曲線在208nm處有一最低負(fù)峰,此與α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰類似,而在7d時(shí),在217nm處有一最低負(fù)峰,與β-折疊結(jié)構(gòu)的特征峰一致。WST-1法和熒光顯微鏡結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在OA濃度為140μM時(shí),OA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞和NSCs具有明顯的增殖抑制作用(P0.01),而當(dāng)OA與HEWL共孵育后,OA-HEWL對(duì)細(xì)胞的毒性明顯減弱。結(jié)論:OA膠束與HEWL共孵育后可以促進(jìn)類淀粉樣蛋白板塊的形成,并能顯著降低OA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞和NSCs的毒性作用。目的:通過提取高純度的S100A9蛋白和構(gòu)建核轉(zhuǎn)錄因κB(NF-κB)p65基因過表達(dá)慢病毒載體并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞,觀察S100A9介導(dǎo)的NF-κB(p65)入核動(dòng)態(tài)變化對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞系的生物學(xué)效應(yīng)。方法:利用前期實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒p ET28aS100A9,提取并轉(zhuǎn)化質(zhì)粒;使用IPTG誘導(dǎo)S100A9蛋白表達(dá);采用SDS-PAGE和WB對(duì)S100A9蛋白進(jìn)行驗(yàn)證;采用鎳親和柱分離并純化蛋白;透析、濃縮并低溫凍干獲得蛋白粉;利用PCR方法獲取目的基因片段RELA(p65),并構(gòu)建慢病毒載體;瓊脂糖凝膠電泳鑒定成功后用構(gòu)建好的慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞;以最適的MOI感染SHSY5Y細(xì)胞,并篩選SH-SY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)株;運(yùn)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測病毒轉(zhuǎn)染效率;采用CCK-8法檢測S100A9蛋白對(duì)SH-SY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)株活性的影響;運(yùn)用Matlab(R2017a)分析軟件分析S100A9蛋白對(duì)SH-SY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞核內(nèi)外p65表達(dá)量的影響。結(jié)果:SDS-PAGE和WB證明成功獲取了高純度蛋白。瓊脂糖凝膠電泳顯示成功構(gòu)建p65基因過表達(dá)的慢病毒載體;CCK-8結(jié)果顯示S100A9對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞具有明顯增殖抑制作用(P0.05),且p65-GFP組的抑制作用沒有對(duì)照組和空載組強(qiáng),對(duì)照組和空載組二者無顯著性差異;熒光顯微鏡和流式細(xì)胞結(jié)果顯示構(gòu)建的SH-SY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)株轉(zhuǎn)染率約達(dá)90%,SH-SY5Y穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功。Matlab分析結(jié)果顯示S100A9蛋白可以激活NF-κB信號(hào)通路,引起p65入核,且入核與陽性對(duì)照TNF-α刺激NF-κB入核存在差異。結(jié)論:S100A9促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞增殖抑制可能是激活了NF-κB信號(hào)通路。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R749.16;R329.2
【圖文】：

/min 的掃描速度和 1nm 分辨率來獲取光譜結(jié)果相對(duì)橢圓率表示。淀粉樣蛋白質(zhì)最初的狀態(tài)主要成為原纖維或者成熟纖維后主要以 β-折疊二級(jí)結(jié)后光譜曲線特征峰位置的變化，初步判斷原纖維WL（左），1.4mMHEWL+14mMOA（中）和 1.在 20 mM 甘氨酸緩沖液中以 800 rpm，pH 2.3 顯示 HEWL 和 OA 混合物樣品形成乳樣外觀，O

2.2 AFM 與熒光顯微鏡觀察纖維形貌結(jié)構(gòu)使用 AFM 連續(xù) 7 天觀察在有或沒有 OA 膠束存在情況下 HEWL 淀粉樣蛋白纖維化的過程（圖 1.2）。結(jié)果顯示，HEWL 在孵育 1 天后，觀察到有原纖維的形成，其高度約為 5nm，持續(xù)孵育到第 7 天的時(shí)候，并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)變化（圖 1.2 和圖 1.3）。在低 OA 濃度（14mM OA）的條件下，與 HEWL 共孵育 1天后，原纖維形成與 HEWL 組原纖維形態(tài)類似，其高度也約為 5nm，同時(shí)出現(xiàn)較多圓形 HEWL 聚集體。與 HEWL 組和低濃度 OA 組相比較，140mM OA 與1.4mM HEWL 共孵育 1 天時(shí)，觀察到大量圓形聚集體形成，這些寡聚體進(jìn)一步聚集形成纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖 1.4），且 AFM 高度測量基本都大于 10nm，高度范圍為 20~60nm，直徑超過 90nm（圖 1.2 和圖 1.3），提示持續(xù)搖動(dòng)作為一種攪拌方式，不僅可以促進(jìn) HEWL 淀粉樣蛋白的形成，而且還可以幫助 OA 消散成小膠束（直徑約 2μm），且 OA 膠束可誘導(dǎo)蛋白寡聚化和纖維化。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 楊玉榮;佘銳萍;梁宏德;;Toll-NF-κB信號(hào)途徑及其介導(dǎo)的功能[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2007年04期

2 李龍宣;趙斌;許志恩;邢孔鴦;唐榮華;;癡呆患者血清和腦脊液中炎前和抗炎細(xì)胞因子的變化[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2007年05期

3 張均田;老年癡呆的發(fā)病機(jī)理及治療策略[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2000年08期

本文編號(hào)：2721425