發(fā)布時(shí)間：2020-06-18 19:30

【摘要】：痘苗病毒(Vaccinia virus,VV)曾經(jīng)作為疫苗預(yù)防天花,并幫助人類最終消滅天花。此后,痘苗病毒多被改造為活病毒載體,應(yīng)用于抗AIDS、流感等感染性疾病及腫瘤的疫苗研究。至今已有多個(gè)痘苗病毒為載體的疫苗進(jìn)入了臨床研究階段。然而,痘苗病毒是一種基因組巨大、基因數(shù)量眾多的DNA病毒,尚存有許多未知需要深入研究。為適應(yīng)各種不同應(yīng)用需要,痘苗病毒還需要進(jìn)一步改造和優(yōu)化。痘苗病毒主要形成2種感染形式的病毒顆粒:胞內(nèi)成熟病毒(intracellular mature virus,IMV)和胞外囊膜病毒(extracellular enveloped virus,EEV)。與占絕大多數(shù)的IMV相比,EEV占比小于1%,但具有早釋放、早感染、遠(yuǎn)距離傳播等優(yōu)勢。因此,我們推測改變痘苗病毒EEV的釋放可能會對病毒的感染及其免疫原性產(chǎn)生影響。EEV的釋放包含兩個(gè)關(guān)鍵步驟:依賴微管的運(yùn)輸以及從細(xì)胞膜上的解離。本研究以天壇株痘苗病毒(Tiantan Vaccinia Virus,VTT)為研究對象,選擇可能與痘苗病毒EEV釋放的兩個(gè)關(guān)鍵步驟相關(guān)的基因進(jìn)行缺失或突變改造,比較研究了改造后病毒的復(fù)制、EEV的釋放特性及外源抗原的表達(dá),評估和篩選出能促進(jìn)抗原免疫應(yīng)答的新型重組痘苗病毒載體。一,本研究試圖通過對病毒依賴微管的運(yùn)輸相關(guān)的A36R、F12L基因進(jìn)行缺失改造,改變病毒依賴微管的EEV釋放,從而促進(jìn)病毒向粘膜基底面的釋放。由于F12L基因缺失的重組病毒rVTT△F12L-GFP難以擴(kuò)增,我們重點(diǎn)分析了A36R基因缺失的重組病毒rVTT△A36R-GFP與野生型VTT在病毒復(fù)制和EEV釋放方面的差別。體外結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組病毒rVTT△A36R-GFP在非極化的黏膜上皮細(xì)胞Caco-2中的EEV釋放和病毒復(fù)制能力下降;在極化的Caco-2細(xì)胞transwell系統(tǒng)中,病毒向腔面和底側(cè)面的釋放均下降。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組病毒rVTT△A36R-GFP在小鼠鼻和肺組織中復(fù)制產(chǎn)生的總病毒量顯著減少。上述結(jié)果表明:缺失A36R基因?qū)е露幻绮《綞EV釋放減少,在粘膜細(xì)胞和體內(nèi)局部的復(fù)制下降,不是一種合適的改造方案。二,本研究試圖通過對病毒從細(xì)胞膜上解離相關(guān)的A34R、B5R基因進(jìn)行點(diǎn)突變改造,從而增加EEV的釋放。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型病毒(VTT)相比,重組病毒rVTT-B5R_(mut)僅能輕微增加EEV的釋放和總子代病毒的產(chǎn)生,而rVTT-A34R_(mut)則能顯著增強(qiáng)EEV的釋放和總子代病毒的產(chǎn)生。因此,我們以rVTT-A34R_(mut)為載體,插入HIV env蛋白作為模式抗原,構(gòu)建了重組HIV疫苗rVTT-A34R_(mut)-Env。與對照病毒rVTT-Env相比,rVTT-A34R_(mut)-Env在體外細(xì)胞系和小鼠肌肉組織中均顯著提高了子代病毒的產(chǎn)生和外源抗原的表達(dá)量,并最終在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了更強(qiáng)的HIV Env特異性的細(xì)胞和抗體應(yīng)答水平。此外,重組疫苗rVTT-A34R_(mut)-Env表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性和動物毒性,具有較好的安全性。上述結(jié)果表明:能增強(qiáng)EEV釋放的重組病毒rVTT-A34R_(mut)是一種能增強(qiáng)重組疫苗免疫原性的新型重組痘苗病毒疫苗載體。此外,本研究通過對一株已進(jìn)入臨床研究的痘苗病毒載體疫苗VTKgpe的A34R基因點(diǎn)突變改造,有效提高了其誘導(dǎo)的HIV Env特異的抗體應(yīng)答,證明了A34R點(diǎn)突變也能在其他痘苗病毒載體疫苗中起到增強(qiáng)免疫應(yīng)答的效應(yīng),表明通過A34R基因K151E點(diǎn)突變增強(qiáng)EEV的釋放是一種能提高免疫原性的重組痘苗病毒載體改造方案。綜上所述,本論文系統(tǒng)研究了改變痘苗病毒本身EEV釋放特性的改造方案對重組病毒復(fù)制,外源抗原表達(dá)和重組疫苗免疫原性的影響。本研究篩選出了一種高效安全的新型VTT疫苗載體rVTT-A34R_(mut),并證明了A34R點(diǎn)突變的改造方式同樣適用于其他痘苗病毒載體。因此,本研究不僅為如何構(gòu)建更安全高效的痘苗病毒疫苗載體提供了一個(gè)實(shí)例,更提供了一種新的思路。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢病毒研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 莊柯;針對HIV-1 B’亞型首株SHIV及減毒痘苗病毒載體重組疫苗的構(gòu)建[D];武漢大學(xué);2005年

本文編號：2719727